研究背景炎症性肠病（IBD）是慢性肠道炎症性疾病,肠源性炎症因子可经循环影响其他器官,IBD相关骨病是常见肠外并发症。破骨细胞过度激活和血清标志物升高证明骨吸收增加,而对骨形成的了解则较为缺乏。目前骨丢失的治疗以抗骨吸收药物为主,但促骨合成代谢更适于改善骨量低下,故明确IBD中骨形成的变化有利于开发有效的干预手段。骨形成由成骨细胞介导,与脂肪细胞共同起源于骨髓间充质干细胞（BMSC）。炎症因子能抑制BMSC增殖和成骨分化来减少骨形成,导致骨量和质量降低、骨髓脂肪组织积累。靶向给药调节BMSC分化命运能使其倾向于成骨而非成脂分化来改善骨丢失,因此是通过促骨合成代谢治疗IBD相关骨病的可行策略。BMSC增殖分化与血管生成相关,涉及血管内皮细胞迁移,共同组成“BMSC-内皮细胞生态位”。E-selectin在血管内皮细胞上表达,与配体高尔基糖蛋白1（GLG1）结合使循环中的细胞靶向骨组织。外泌体是天然的细胞外囊泡,生物相容性和循环稳定性优良,根据受体-配体相互作用还可被修饰为靶向载药纳米颗粒。本课题中我们通过体内实验明确IBD相关骨病中骨量、骨质量、骨形成、骨髓脂肪积累的变化,通过体外实验探讨IBD相关骨病中BMSC的成骨和成脂分化潜力以及炎症影响BMSC成骨分化的潜在机制,最终评估基于外泌体的靶向BMSC载药纳米颗粒对IBD相关骨病的治疗效果。研究目的第一部分:明确小鼠模型中IBD对松质骨、皮质骨、骨力学性能、骨髓脂肪组织以及骨形成、成骨细胞数量、脂肪细胞数量的影响。第二部分:探讨来源于IBD小鼠骨髓的BMSC在体外培养中的增殖能力、成骨和成脂分化潜力以及细胞信号通路变化,在体外模拟BMSC炎症微环境探索其影响BMSC成骨分化的潜在机制。第三部分:构建基于GLG1外泌体的靶向BMSC载药纳米颗粒,评估其治疗IBD相关骨病的效果。研究方法第一部分:（1）葡聚糖硫酸钠和吡罗昔康构建IBD小鼠模型。（2）μCT检查骨量和骨髓脂肪组织量。（3）应力实验评估股骨力学性能。（4）钙黄绿素双标实验评估小鼠股骨骨形成率（BFR）和矿物沉积率（MAR）。（5）H＆E染色、TRAP染色、Goldner三色染色评估结肠和股骨组织形态学变化。（6）免疫荧光（IF）和免疫组织化学（IHC）染色评估成骨细胞和脂肪细胞数量。（7）q RT-PCR和WB检测成骨、成脂分化相关基因的表达。第二部分:（1）q RT-PCR检测细胞因子、成骨和成脂分化相关基因转录水平。（2）流式分选收集小鼠骨髓中的BMSC。（3）集落形成实验评价BMSC增殖能力。（4）茜素红染色、碱性磷酸酶染色、Von Kossa染色评价BMSC成骨分化潜力,油红染色评价成脂分化潜力。（5）转录组测序（RNA-seq）探究BMSC细胞信号通路基因差异表达。（6）TNF-α体外模拟BMSC炎症微环境。（7）Co-IP检测β-catenin-p50相互作用。（8）IB检测β-catenin和NF-κB通路下游分子细胞内总量。（9）荧光素酶报告基因实验评估β-catenin转录活性。（10）放线菌酮追踪实验评估β-catenin降解速率。（11）Ch IP实验评估β-catenin调控的成骨分化相关基因的转录活性。第三部分:（1）构建过表达GLG1的NIH-3T3细胞系。（2）超速离心法收集外泌体,挤出法搭载Wnt通路激活剂,构建GLG1载药纳米颗粒（NP）。（3）透射电镜、粒径分析以及WB评估NP表征。（4）活体荧光成像检测NP的体内分布。（5）IF染色评估NP、血管内皮细胞以及BMSC的位置。（6）参照第一部分方法评价小鼠股骨或骨痂的骨量、骨髓脂肪组织量、力学性能、BFR、MAR、成骨细胞以及脂肪细胞数量。（7）番红固绿染色评估股骨软骨痂和矿化骨痂。研究结果第一部分:（1）IBD小鼠均表现出结肠短缩、体重减轻、结肠炎症浸润等。（2）μCT结果显示IBD小鼠相比于对照组,松质骨减少、皮质骨变薄、骨髓脂肪组织增多。（3）应力实验结果显示IBD小鼠股骨力学性能下降。（4）钙黄绿素双标实验显示IBD小鼠股骨BFR和MAR下降。（5）组织形态学染色证明IBD小鼠股骨松质骨和类骨质减少而脂肪细胞和破骨细胞增多。（6）IF、IHC染色分别显示IBD小鼠股骨内成骨细胞减少、脂肪细胞增多。（7）IBD小鼠成骨分化相关基因表达减少、成脂分化相关基因表达增加。第二部分:（1）IBD小鼠骨组织内的炎症因子转录水平高于对照组。（2）IBD小鼠的BMSC相比于对照组,形成集落数量更少,成骨诱导后碱性磷酸酶分泌和钙盐沉积更少,成脂诱导后含脂滴的细胞数量更多。（3）RNA-seq结果经GO分析、KEGG分析、GSEA分析后表明IBD小鼠BMSC中Wnt/β-catenin信号通路下调而PPARγ信号通路上调（p＜0.05）。（4）TNF-α的处理会减少BMSC中β-catenin-p50的结合、减少β-catenin总量、降低β-catenin的转录活性,增加p-IKKβ和p-p50的总量、增加β-catenin的泛素化程度和单位时间内减少量,最终降低细胞核内的β-catenin水平,使成骨分化相关基因runx2和osterix转录活性下降。第三部分:（1）透射电镜、粒径分析、WB结果显示载药NP与外泌体性状类似,但GLG1-NP上GLG1的表达量高于CTRL-NP。（2）GLG1-NP比CTRL-NP更能富集于骨组织并驻留。（3）GLG1-NP治疗的IBD小鼠相较于Vehicle治疗的IBD小鼠,减少的松质骨增加,变薄的皮质骨增厚,骨髓脂肪组织体积占比降低,力学性能改善。同时GLG1-NP治疗使IBD小鼠股骨的BFR和MAR升高、成骨细胞增多、脂肪细胞减少。（4）GLG1-NP相较于Vehicle治疗的骨折IBD小鼠,在术后21天时其骨性骨痂较多,骨痂力学性能较优,相对骨痂矿化量较高。研究结论第一部分:IBD小鼠骨量、骨质量下降,骨形成减少,骨髓脂肪增加。第二部分:IBD的骨髓炎症微环境会使BMSC增殖能力下降、成骨分化能力受限而成脂分化能力增强。BMSC中Wnt/β-catenin信号通路显著下调,潜在机制是炎症激活NF-κB信号通路使β-catenin泛素化和降解增加。第三部分:GLG1-NP能靶向骨组织,递送Wnt通路激活剂使BMSC成骨分化和骨形成增加,提高IBD小鼠的骨量和骨质量,并促进骨折愈合。综上,我们证实IBD中存在骨量、骨质量以及骨形成下降,且BMSC的成骨分化受抑;靶向BMSC激动下调的Wnt/β-catenin通路可以促进BMSC成骨分化和骨形成,从而治疗IBD相关骨病。