背景:肝癌是世界范围常见恶性肿瘤之一,以肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma,HCC）为主。随着基础和临床研究的进展,肝癌的治疗效果在过去十几年间得到了较大的进展。由于肝癌早期诊断率较低,且且肝癌耐药性强、易远处转移,HCC 5年生存率仍低于50%。因此,阐明HCC进展的潜在机制和新的作用靶点至关重要,以便开发出可有效对抗或者延缓HCC的治疗药物。缺氧是实体肿瘤的一个重要特性,尤其是HCC。近年来研究发现,缺氧可诱导癌细胞侵袭、转移和上皮-间充质转化（Epithelial-mesenchymal transition,EMT）,增强癌细胞的干性。肝癌干性是肝癌发生发展的根本动力,缺氧是维持和激活肝癌干性的主要原因。因此,改善HCC内部的缺氧微环境抑制肝癌干性特征是HCC治疗的关键一步。中医药用于预防和治疗肝病已经有很长的历史,越来越多的证据表明:中药可以延缓HCC的进展,提高HCC患者的生活质量。本单位根据多年临床经验,总结出针对肝癌的中药复方“解毒方（Jie Du Fang,JDF）”,在临床上取得了良好的效果。我们通过网络药理学分析发现,JDF可以富集到缺氧诱导因子（Hypoxia-inducible factor,HIF）以及与干性调控高度相关的Wnt通路上,Affymetrix基因芯片结果分析显示JDF主要对Wnt/β-catenin信号通路起抑制作用。在缺氧微环境下,通过细胞因子芯片发现JDF的作用靶点可能为Cripto-1,该蛋白在多种肿瘤中（包括肝癌）呈现高表达,且已证实Cripto-1可以激活肝癌Wnt/β-catenin信号通路。因此,本课题提出假设,解毒方可以在缺氧微环境下经Wnt/β-catenin信号通路降低肝癌干性,且该作用与解毒方对Cripto-1的调控作用有关。目的:1.观察解毒方在缺氧微环境下对肝癌“干性”的作用。2.明确缺氧微环境下Wnt/β-catenin信号通路在解毒方降低肝癌“干性”中的作用。3.初探Cripto-1与解毒方在缺氧微环境下经Wnt/β-catenin信号通路降低肝癌“干性”是否相关。方法:第一部分:观察解毒方在缺氧微环境下对肝癌“干性”的作用1.通过网络药理学探索JDF治疗HCC的药理机制,利用TCMSP数据库,知网文献搜集JDF的主要成分及对应靶点。利用GENECARDS数据库获取HCC的对应靶点,将药物预测靶点与疾病靶点相互映射,取交集。利用DAVID在线分析工具对交集靶点进行基因功能分析,KEGG通路富集分析。2.MTT实验、划痕实验、Transwell小室侵袭实验检测在缺氧微环境下JDF对于人肝癌细胞SMMC-7721（7721）和Huh7细胞系的增殖、迁移和侵袭能力的影响。3.Western blot和RT-PCR检测JDF在缺氧微环境中对于7721和Huh7细胞中EMT相关蛋白（E-cadherin、Vimentin、α-SMA）的影响。4.Image-ITTM Hypoxia Reagent检测在缺氧微环境下JDF对于7721和Huh7细胞中缺氧的改善作用。5.Western blot以及Realtime-PCR（RT-PCR）检测在缺氧微环境下JDF对于7721和Huh7细胞中缺氧关键蛋白HIF-1α表达的影响。6.无血清悬浮球培养法富集肝癌干细胞,检测JDF在缺氧微环境中对于悬浮球成球能力的影响。7.RT-PCR检测在缺氧微环境中JDF对于7721和Huh7细胞中干性转录因子（NANOG、Oct4、Sox2）m RNA的影响。8.建立裸鼠皮下瘤模型进一步在体内验证解毒方对于小鼠体内瘤块缺氧、EMT和干性的影响。第二部分:明确缺氧微环境下Wnt/β-catenin信号通路在解毒方降低肝癌“干性”中的作用1.Affymetrix基因芯片分析JDF降低HCC干性的分子机制。2.7721和Huh7细胞中加入Wnt/β-catenin信号通路激动剂氯化锂（Li Cl）,Western blot检测JDF对于维持肿瘤细胞干性的主要通路Wnt/β-catenin信号通路中的β-catenin和p-GSK3β（Ser9）的影响。RT-PCR检测加入Li Cl后JDF对于7721和Huh7细胞中干性相关转录因子的影响。3.Western blot检测在缺氧微环境下JDF对于Wnt/β-catenin信号通路中β-catenin和p-GSK3β（Ser9）的影响。4.Western blot检测在缺氧微环境下加入Wnt/β-catenin信号通路抑制剂IWR-1-endo,JDF对于Wnt/β-catenin信号通路中β-catenin的影响。同时RT-PCR检测对于干性转录因子（NANOG、Oct4、Sox2）m RNA的影响。5.体内验证JDF对于荷瘤裸鼠瘤组织中Wnt/β-catenin信号通路β-catenin的影响。第三部分:初探Cripto-1对解毒方在缺氧微环境下经Wnt/β-catenin信号通路降低肝癌“干性”的调控机制。1.Human XL Cytokine Array Kit试剂盒检测JDF在缺氧微环境肝癌细胞7721细胞因子分泌的影响。2.Western blot和RT-PCR检测在缺氧微环境中7721和Huh7细胞内Cripto-1的表达,以及JDF对于Cripto-1的影响。3.Western blot检测Cripto-1对于Wnt/β-catenin信号通路的影响,以及JDF干预后的效果。4.Western blot检测在缺氧微环境中,加入Cripto-1刺激后,JDF对于对于缺氧关键蛋白HIF-1α以及Wnt/β-catenin信号通路的影响。同时RT-PCR检测对于干性转录因子（NANOG、Oct4、Sox2）的影响。结果:第一部分:观察解毒方在缺氧微环境下对肝癌“干性”的作用1.通过数据库检索获得JDF有效活性成分共6个,对应靶点171个。GENECARDS检索出HCC相关靶点,将JDF的靶点与HCC靶点进行匹配,共得到81个共同靶点。再利用DAVID数据库对GO生物过程和KEGG通路进行分析,以P＜0.05进行筛选,发现差异靶点基因可以富集到HIF和Wnt信号通路。2.MTT结果表明JDF在缺氧微环境下可以有效地抑制人肝癌细胞7721和Huh7的增殖,呈浓度依赖和剂量依赖。3.划痕实验和Transwell侵袭实验显示,缺氧增强肝癌细胞迁移、侵袭能力,JDF可以抑制该效应。4.Western blot实验表明缺氧能够增强肝癌细胞的EMT（E-cadherin表达降低,Vimentin和α-SMA表达升高）,JDF能够抑制EMT。RT-PCR实验表明缺氧微环境下E-cadherin的m RNA水平降低,Vimentin和α-SMA的m RNA水平升高（P＜0.05）,JDF能够拮抗缺氧微环境下EMT（P＜0.05）,但JDF对于7721细胞的Vimentin和α-SMA抑制效果不具有统计学意义,表明JDF在7721细胞中是在蛋白层面抑制EMT。5.Image-ITTM Hypoxia Reagent实验表明缺氧能够增强肝癌细胞内的缺氧情况（绿色荧光代表细胞缺氧）,JDF可以抑制该效应。6.Western blot实验表明缺氧能够增强缺氧关键蛋白HIF-1α的表达,JDF能够抑制改效应。RT-PCR实验表明在缺氧微环境下,7721细胞中的HIF-1α的m RNA水平相比较常氧下升高（P＜0.05）,Huh7细胞不具有统计学意义,但JDF可以在缺氧微环境下抑制HIF-1α的m RNA水平（P＜0.05）。7.干细胞悬浮球成球实验显示缺氧能够增强肝癌细胞悬浮球的成球个数（P＜0.05）,JDF可以抑制该效应（P＜0.05）。8.RT-PCR实验显示缺氧能够增强肝癌细胞中的干性转录因子（NANOG、OCT4、Sox2）的表达（P＜0.05）,JDF可以抑制该效应（P＜0.05）。9.7721细胞系建立裸鼠皮下瘤模型,结果显示,JDF灌胃组裸鼠体重以及瘤体大小比对照组明显降低（P＜0.05）。Western blot、免疫组化和RT-PCR在蛋白和m RNA的层面进行实验验证,结果表明:与对照组相比,JDF抑制了HIF-1α的表达且能够明显改善EMT（E-cadherin表达升高,vimentin和α-SMA表达降低）。肿瘤组织缺氧探针(HypoxyprobeTM-1)显示JDF可以改善瘤内缺氧。RT-PCR结果显示:与对照组相比JDF能够明显抑制干性转录因子（NANOG、Oct4、Sox2）（P＜0.05）。第二部分:明确缺氧微环境下Wnt/β-catenin信号通路在解毒方降低肝癌“干性”中的作用1.基于Affymetrix基因芯片结果,KEGG pathway和IPA分析显示JDF对7721悬浮球细胞中的Wnt/β-catenin信号通路产生显著的抑制作用。2.Western blot实验表明加入Li Cl后可以激活Wnt/β-catenin信号通路中β-catenin（细胞核和胞浆）和p-GSK3β（Ser9）表达,JDF可以抑制该效应。RT-PCR实验表明加入Li Cl后,干性转录因子NANOG、OCT4、Sox2的m RNA水平提高（P＜0.05）,JDF可以抑制该效应（P＜0.05）。3.Western blot实验表明缺氧能够使得Wnt/β-catenin信号通路中β-catenin（细胞核和胞浆）和p-GSK3β（Ser9）表达升高,表明缺氧微环境下能够激活Wnt/β-catenin信号通路,JDF能够抑制该效应。4.Western blot实验表明加入Wnt/β-catenin信号通路抑制剂IWR-1-endo在缺氧微环境下,相比较没有加抑制剂,β-catenin的表达可以有效的被抑制,并且再加入JDF对于β-catenin的表达改变不大。RT-PCR结果显示缺氧微环境加入IWR-1-endo,干性转录因子NANOG,Oct4和Sox2的m RNA表达降低（P＜0.05）,加入JDF后改变不大。5.Western blot和免疫荧光实验结果显示在裸鼠皮下瘤内JDF组相比较对照组可以有效的抑制β-catenin的表达。第三部分:初探Cripto-1与解毒方在缺氧微环境下经Wnt/β-catenin信号通路降低肝癌“干性”是否相关1.Human XL Cytokine Array Kit细胞因子芯片检测结果提示在缺氧微环境下Cripto-1表达升高,并且JDF在缺氧微环境下能够对Cripto-1产生明显抑制作用。2.Western blot实验发现Cripto-1在缺氧微环境下表达升高,JDF可以抑制Cripto-1的表达。RT-PCR实验在缺氧微环境下Cripto-1的m RNA水平提高（P＜0.05）,JDF可以降低Cripto-1的m RNA水平（P＜0.05）。3.Western blot实验发现加入Cripto-1细胞因子后,Western blot检测β-catenin和p-GSK3β（Ser9）表达升高,加入JDF干预后,可以抑制β-catenin和p-GSK3β（Ser9）的表达。4.在缺氧微环境下再加入Cripto-1细胞因子,Western blot结果发现Cripto-1能够提高HIF-1α和β-catenin的表达,7721细胞中p-GSK3β（Ser9）表达降低,Huh7细胞中p-GSK3β（Ser9）表达升高。加入JDF后可以抑制HIF-1α和β-catenin的表达。RT-PCR结果显示,缺氧微环境下加入Cripto-1,与Huh7细胞对照组相比,缺氧能够激活干性相关调控因子NANOG,Oct4,Sox2的m RNA水平（P＜0.05）;与7721细胞对照组相比,缺氧能够激活Sox2的表达（P＜0.05）。JDF干预,能够降低NANOG,Oct4,Sox2的m RNA水平（P＜0.05）。结论:1.JDF在缺氧微环境下能够降低肝癌的“干性”,抑制增殖、迁移和侵袭能力,降低肝癌细胞的EMT。2.JDF在缺氧微环境中降低肝癌的“干性”与抑制Wnt/β-catenin信号通路密切相关。3.JDF在缺氧微环境下可以通过降低Cripto-1抑制Wnt/β-catenin信号通路。