第一部分神经移位重建高位颈髓损伤大鼠呼吸功能研究目的:高位颈髓损伤患者膈肌瘫痪、呼吸功能丧失,死亡率极高。本课题组聚焦高位颈髓损伤患者呼吸功能重建这一临床难点问题,通过膈神经-迷走神经移位技术,成功重建高位颈髓损伤大鼠的膈肌运动。本部分旨在论证神经移位对恢复高位颈髓损伤后膈肌功能的可行性。研究方法:构建迷走神经-膈神经端侧吻合的大鼠模型,在神经移位6个月后,于C3水平建立脊髓损伤打击模型,对比假手术组大鼠和神经移位组大鼠高位颈髓损伤后的存活时间;通过电生理检测膈肌复合肌肉动作电位（CMAP）,评估神经移位各时间点CMAP的波幅（Amp）和潜伏期（Lat）的恢复情况;利用X线透视观察大鼠的膈肌运动,比较吸气末和呼气末膈肌中点的垂直位移来测量呼吸动度,评估神经移位对膈肌的再支配的程度;对吻合后的神经行甲苯胺蓝染色,通过有髓神经纤维计数,量化神经再生情况。结果:（1）在10倍手术显微镜下,用12-0缝合线完成迷走神经-膈神经的无张力端侧吻合。术后6月,C3水平高位颈髓损伤建模,神经移位组大鼠的存活时间明显高于对照组（6.87±3.36 min vs.6.63±3.11 h）,证明神经移位可以有效恢复高位颈髓损伤后的膈肌运动。（2）连续观察神经移位后膈肌复合肌肉动作电位（CMAP）,结果显示在神经移位后的各时间点,CMAP的潜伏期（Lat）逐渐缩短、波幅（Amp）逐渐增大。至神经移位6月,膈肌CMAP的潜伏期（Lat）为3.48±0.40ms,较对照组恢复了69.0%;膈肌CMAP的波幅为5.16±0.478m V,较对照组恢复了71.4%。提示神经再生趋于稳定。（3）大鼠胸部X线透视下观察吸气末和呼气末膈肌中点的垂直位移来测量呼吸动度。结果显示,将正常大鼠建立高位颈髓损伤模型后,膈肌失神经支配而瘫痪,大鼠仅能短暂存活;神经移位6个月大鼠高位颈髓损伤后,呼吸依然存在,呼吸动度接近正常,为0.54±0.06cm。（4）甲苯胺蓝染色观察有髓神经纤维的再生情况,结果显示神经移位6月后,可见有髓神经纤维已基本再生完全。但与正常组相比,移位组髓鞘较薄且大小不一,板层排列较为无序。移位组再生神经的有髓轴突计数为240.00±37.72,有髓神经纤维再生率为64.9%。同时,比较供体神经（迷走神经）吻合口近端和远端的有髓神经纤维数量,结果显示无统计学意义,说明端侧吻合对供体神经干扰较小,有效地保留了迷走神经对机体复杂而重要的功能。研究结论:采用膈神经-迷走神经端侧移位的手术方式,可以有效重建高位颈髓损伤大鼠的呼吸功能,延长高位颈髓损伤后的存活时间。采用迷走神经作为供体神经,在不损伤其重要功能的前提下,端侧吻合具有良好的神经再生效果。第二部分外周神经移位过程中的皮层中枢神经环路重塑研究目的:大量研究表明大脑皮层需要在周围神经损伤和神经移位后再适应或再学习,神经移位技术的良好临床效果取决于周围神经再生能力和皮层可塑性的适应能力。目前对膈神经移位重建呼吸功能的研究大部分都围绕在供体神经的选择及靶器官的功能恢复上,通过该技术重建呼吸功能的过程中是否能触发广泛的皮层功能重组目前尚不清楚。本部分对神经移位前后支配膈肌的各级神经中枢进行比较,阐明神经移位后神经环路的变化。研究方法:使用可逆行跨多级突触的伪狂犬病毒（PRV）分别感染正常大鼠的膈神经、迷走神经以及神经移位大鼠的吻合口远端膈神经,对正常大鼠和神经移位大鼠支配膈肌的大脑皮层高级中枢进行定位,明确神经移位前后的神经通路;对正常大鼠和神经移位大鼠分别行静息态功能磁共振（rs-f MRI）检查,通过低频振荡波幅（ALFF）和局部一致性（Re Ho）等指标,分析神经移位前后皮层中枢兴奋区的差异。结果:（1）神经移位6个月后进行的伪狂犬病毒（PRV）逆行示踪显示,病毒经膈神经逆行感染至迷走神经、迷走神经的低级中枢、迷走神经的皮层中枢,最终到达了支配膈神经的皮层中枢（初级运动皮层）。也就是说,在神经移位后,原本没有联系的膈神经皮层中枢和迷走神经皮层中枢之间形成了新的神经环路,膈神经皮层中枢可以通过迷走神经的神经网络重新支配膈肌的运动;（2）与对照组大鼠相比,神经移位组大鼠的静息态功能磁共振显示双侧膈神经皮层中枢（初级运动皮层）的ALFF值和Re Ho值显著增加,提示膈神经皮层中枢的神经元自发活动水平增高,局部神经元自发活动在时间上趋于同步,膈神经皮层中枢自发活动一致性增高,脑区的功能加强。研究结论:神经移位后,大脑总是试图恢复原本的皮层代表区对患肌的控制。通过神经环路重塑恢复皮层中枢原本功能区对患肌的支配,是功能有效重建的标志。膈神经与迷走神经端侧吻合后,大脑皮层功能区发生重塑,原本没有联系的膈神经皮层中枢（初级运动皮层）和迷走神经皮层中枢之间形成了新的神经环路,膈神经皮层中枢可以通过迷走神经的神经网络重新支配膈肌的运动。通过神经环路重塑大脑皮层中原本膈肌功能区实现对膈肌的再支配。第三部分IGFBP-6/IGFs/IGF-1R轴在神经元可塑性中的机制研究研究目的:神经元的可塑性是神经环路能够发生重塑的前提条件。在神经环路重塑的过程中,神经元通过大量的基因和分子以及复杂的细胞内和细胞间的信号转导对神经元的形态和功能进行复杂的调控。因此,理解突触可塑性的分子机制是解析神经环路重塑的前提条件之一。研究方法:对神经移位后,发生神经环路重塑的关键部位-膈神经皮层中枢（初级运动皮层）进行10×Genomics空间转录组测序,直观可视化地定量分析膈神经皮层中枢在神经环路重塑过程中的相关基因表达差异和细胞行为变化,并对下游潜在的信号通路进行挖掘和验证。结果:（1）空间转录组学测序针对膈神经皮层中枢的spots进行无监督聚类,将具有相似基因表达谱信息的spots聚类为8个cluster。结果发现,神经移位cluster1和4在同一个空间位置发生了明显的变化,神经移位后cluster1占比增高,cluster4占降低。针对cluster1和4的拟时序分析显示,二者在时间轴上具有明显的演化过程。进一步针对时序过程中的所有高变基因进行分析,发现IGFBP-6基因在时间轴上随着cluster4向cluster1的分化,其表达量逐渐升高;（2）空间转录组学测序在膈神经皮层中枢共鉴定到差异表达基因76个,其中神经移位组上调表达基因40个,下调表达基因36个。IGFBP-6在神经移位组的膈神经皮层中枢明显上调表达;（3）免疫共沉淀（Co-IP）实验证实,IGFBP-6调控IGFs（IGF-1和IGF-2）与IGF-1R的竞争性结合。IGFBP-6通过与IGF-2的高亲和力结合,抑制后者与IGF-1R的结合,从而更多的IGF-1R位点与游离的IGF-1结合,增强IGF-1的生物学效应;（4）在神经元中过表达或敲低IGFBP-6,免疫荧光结果显示,IGFBP-6OE组神经元体积增大、轴突长度增加且分支复杂、树突棘密度增加。当IGFBP-6OE组细胞中加入PI3K/Akt信号通路抑制剂（Wortmannin）时,逆转了IGFBP-6过表达对细胞的上述作用。证明IGFBP-6通过PI3K/Akt信号通路促进了神经元的结构可塑性;（5）Western-blot显示,过表达IGFBP-6显著增加了突触可塑性相关蛋白SYN、NF-20、PSD-95的表达水平,增加了Akt下游分子Girdin和NR2B的磷酸化水平,而IGFBP-6OE组细胞中加入Wortmannin时,逆转了IGFBP-6过表达对上述蛋白表达水平的增高。说明IGFBP-6通过PI3K/Akt信号通路促进了神经元的功能可塑性。研究结论:高位颈髓损伤后,膈神经皮层中枢对膈肌的控制中断,通过迷走神经-膈神经移位,在呼吸功能有效恢复的同时,皮层中枢原本没有联系的膈神经皮层中枢和迷走神经皮层中枢之间形成了新的神经环路,膈神经皮层中枢可以利用迷走神经的神经网络重新支配膈肌的节律运动。在这个过程中,膈神经皮层中枢通过上调IGFBP-6基因的表达,介导IGFs/IGF-1R轴促进神经元树突棘密度增多、轴突延长和突触传递效能增加,促进了突触的可塑性,实现神经环路的重塑。为加速高位颈髓损伤后呼吸功能的重建、增强自主呼吸功能的临床治疗提供新的思路。