第一部分胰蛋白酶原基因突变在小鼠慢性胰腺炎中的致病作用研究目的:胰蛋白酶原基因（PRSS1）的突变可导致人类遗传性慢性胰腺炎。然而,目前还不清楚PRSS1的突变模式如何促进疾病的发展。因此,我们研究了人源的PRSS1突变在小鼠体内表达的效果。研究方法:在全长型胰腺弹性蛋白酶基因（Elastase）启动子的控制下,在胰腺腺泡细胞中特异性表达了不含突变的人源PRSS1基因和编码R122H突变的PRSS1(PRSS1R122H),BAC小鼠作为对照。予小鼠腹腔注射脂多糖（LPS）诱导慢性胰腺炎,并进一步建立喂养酒精或高脂饮食诱导的慢性胰腺炎小鼠模型。收集胰腺组织,进行组织学、western blot、q RT-PCR和免疫组化等检测。测定胰腺匀浆中胰蛋白酶（Trypsin）活性和糜蛋白酶C（CTRC）活性。研究结果:表达PRSS1或PRSS1R122H突变的转基因小鼠的胰腺仅出现局灶性炎症改变,在PRSS1R122H小鼠中更为突出。与对照组相比,PRSS1或PRSS1R122H小鼠胰腺中NRF2水平升高,CTRC水平降低（适应性保护反应）,胰酶活性没有差异,并不会导致自发性慢性胰腺炎的发生。与PRSS1小鼠或对照小鼠相比,注射LPS后会加剧PRSS1R122H小鼠的胰腺炎症。在酒精喂养或高脂饮食后,表达PRSS1R122H的小鼠比PRSS1小鼠或对照小鼠发生更严重的慢性胰腺炎,表现为更多的DNA损伤、腺泡细胞凋亡、胶原沉积、胰蛋白酶活性和炎症细胞浸润的增加。说明PRSS1R122H结合环境因素的损伤会打破保护性反应造成的稳态,引起严重的慢性胰腺炎。研究结论:PRSS1R122H的转基因小鼠会促进环境损伤因素诱发的炎症反应,增加慢性胰腺炎的严重程度。这些小鼠可作为人类遗传性胰腺炎的模型,并可用于研究LPS、酒精或高脂饮食诱导的慢性胰腺炎的发生机制。第二部分PRSS1R122H突变对环境损伤因素合并Kras突变所致慢性胰腺炎的作用研究目的:明确在环境损伤因素作用下,胰蛋白酶原突变导致的慢性炎症和Kras内源性突变在小鼠慢性胰腺炎中是否存在相互作用。研究方法:利用BAC Elastase-Cre ERT工具鼠与携带Loxp-STOP-Loxp调控表达内源性Kras G12D/+突变的小鼠（LSL-Kras G12D/+,LSL）杂交,得到的BAC Ela Cre ERT;KrasG12D/+双重转基因小鼠（LSL/BAC）,可以由外源性的Tamoxifen给药诱导Cre重组酶活性及胰腺腺泡特异的Loxp-STOP-Loxp剪切,即可在所有的胰腺腺泡细胞特异性表达内源性Kras G12D突变。再将LSL/BAC小鼠分别与第一部分中的在胰腺腺泡细胞中特异性表达人源PRSS1基因（PRSS1）和编码PRSS1R122H突变（R122H）的转基因鼠杂交,获得PRSS1/LSL-Kras G12D/BAC（P/L/B）和PRSS1R122H/LSL-Kras G12D/BAC（R/L/B）的三重转基因小鼠,可在Tamoxifen诱导下分别得到人源PRSS1和Kras G12D单突变,以及PRSS1R122H和Kras G12D双突变在小鼠胰腺腺泡细胞的特异性表达,进行genotyping确认基因型。分别给予高脂和酒精饮食喂养28天,处死后收取胰腺进行病理学评估、天狼星红染色、纤维化指标检测、炎症细胞标志物免疫组化染色、TUNEL凋亡检测和cleaved caspase 3免疫荧光检测、胰蛋白酶活性和CTRC活性检测。研究结果:经高脂或酒精饮食喂养后,与P/L/B组小鼠相比,R/L/B组小鼠胰腺组织H＆E染色结果显示更严重的慢性胰腺炎,表现为更多的腺泡细胞萎缩、炎症细胞浸润和纤维化形成;天狼星红染色可见R/L/B小鼠比P/L/B小鼠胰腺存在更多的胶原沉积,纤维化标志物Collagen-1和胰腺星状细胞活化标志物α-SMA的m RNA和蛋白表达水平R/L/B组均显著高于P/L/B组;R/L/B组小鼠胰腺的炎症细胞标志物（F4/80、CD45、MPO）免疫组化阳性染色面积显著多于P/L/B组;R/L/B组小鼠的TUNEL凋亡信号水平和cleaved caspase 3免疫荧光阳性细胞明显多于P/L/B组。R/L/B组小鼠胰蛋白酶活性明显高于P/L/B组小鼠,但R/L/B组与R/B组小鼠间胰酶活性无显著差异,存在基因突变的小鼠胰腺CTRC的m RNA和蛋白表达量均低于BAC对照组,而双突变的R/L/B组和仅存在R122H突变的R/B组间小鼠CTRC表达无显著差异。研究结论:PRSS1R122H突变可加重环境损伤因素合并Kras G12D突变所致的慢性胰腺炎,且PRSS1R122H突变为始动因素,机制是双突变可增加胰蛋白酶活性,造成腺泡细胞凋亡,炎症加重。第三部分PRSS1R122H突变合并Kras突变在慢性胰腺炎-癌转化中的协同作用及机制研究研究目的:探讨PRSS1R122H和Kras G12D双突变在慢性胰腺炎-癌转化中是否存在协同作用,并找寻其中可能的机制。研究方法:以BAC对照小鼠、PRSS1/LSL-Kras G12D/BAC（P/L/B）和PRSS1R122H/LSL-KrasG12D/BAC（R/L/B）三重转基因小鼠为模型,观察致癌表型差异及相关通路改变,并通过体内实验和体外实验两个层面进行验证。三组小鼠经高脂和酒精饮食喂养28天后处死收取胰腺组织,进行H＆E染色,观察ADM和Pan IN病理改变,并对面积进行统计,通过免疫组化染色和免疫荧光检测ADM和Pan IN的常用标志物。采用琼脂糖珠“pulldown”实验检测胰腺Kras活性,western blot检测下游ERK、AKT/m TOR通路蛋白表达,q RT-PCR、western blot和免疫组化染色检测ATF3及NF-κB的表达。BAC、P/L/B和R/L/B三组小鼠诱导基因型表达后分离提取的原代腺泡细胞进行3D培养,加入酒精刺激,观察腺泡细胞是否出现导管样化生。研究结果:经高脂和酒精饮食喂养后,R/L/B双突变小鼠发生更严重的ADM和Pan IN,免疫组化染色和免疫荧光检测ADM的标志物Amylase、MIST 1和CK19的改变,免疫组化染色检测Muc5、Ki-67及阿利新蓝染色明确Pan IN范围,结果均是R/L/B组小鼠的胰腺更明显。Kras活性检测发现R/L/B组小鼠胰腺中活化的Kras蛋白含量高于P/L/B组,且Kras下游p ERK蛋白表达水平以及ATF3和NF-κB的表达也更高。R/L/B组小鼠3D培养后的腺泡细胞经酒精刺激后导管结构形成更多。研究结论:PRSS1R122H突变合并环境因素损伤可使腺泡细胞发生更严重的内质网应激,ATF3表达显著上调,进而活化NF-κB通路,正反馈持续激活Kras活性及下游ERK通路,导致ADM和Pan IN的发生。总结上述研究,可得出结论如下:胰蛋白酶原PRSS1R122H突变能加重环境因素诱导的慢性胰腺炎,腺泡细胞发生更严重的内质网应激,ATF3表达显著上调,进而活化NF-κB通路,对存在Kras G12D突变的小鼠形成“二次打击”,导致Kras持续活化及下游ERK通路的激活,诱导腺泡细胞凋亡,发生ADM及Pan IN。即PRSS1R122H可加重环境因素诱导Kras G12D突变介导的慢性胰腺炎-癌转化。本研究首次将基因突变与环境因素在慢性胰腺炎-癌转化中的相互作用联系到一起并在模式动物中得以验证,有助于深入认识慢性胰腺炎-癌转化的发生机制,为双突变的慢性胰腺炎患者的临床管理提供参考,为更好地预防和治疗这一病理进程提供潜在靶标。