【摘 要】
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DNA甲基化是作为一类重要的表观遗传修饰,其中5-甲基胞嘧啶（5m Cyt）是最为常见DNA甲基化修饰。5m Cyt在许多生物学功能中发挥着重要作用,除了参与基因表达的调节、细胞发育、细胞谱系控制、基因组印记和细胞衰老等生物学过程外,还与多种疾病的发生和发展密切相关。研究表明,癌基因启动子区的DNA甲基化会影响G-四链体的稳定性。而DNA甲基化是否会通过影响G-四链体结构和性质进而调控癌基因表达,
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DNA甲基化是作为一类重要的表观遗传修饰,其中5-甲基胞嘧啶（5m Cyt）是最为常见DNA甲基化修饰。5m Cyt在许多生物学功能中发挥着重要作用,除了参与基因表达的调节、细胞发育、细胞谱系控制、基因组印记和细胞衰老等生物学过程外,还与多种疾病的发生和发展密切相关。研究表明,癌基因启动子区的DNA甲基化会影响G-四链体的稳定性。而DNA甲基化是否会通过影响G-四链体结构和性质进而调控癌基因表达,目前尚缺乏研究证据。因此,研究DNA甲基化对于G-四链体结构及性质的影响,对于进一步了解DNA甲基化对原癌基因调控具有重要意义。另一方面,对于基因组DNA甲基化水平分析,当前主流的LC-ESI-MS质谱技术存在样本需求量大、前处理方法耗时等局限性。因此,发展一种快速分析DNA甲基化的定量检测方法对于表观遗传学基础研究以及疾病的早期诊断和预后评价都有重要意义。针对以上问题,本文从两个方面对DNA甲基化展开了研究:（1）利用实时直接分析质谱（DART-MS）,开发了一种用于人类癌细胞全基因组DNA甲基化水平的快速定量方法。该方法在传统的DNA封管酸解法的基础上进行了优化,改在离心管中进行细胞酸解处理后,直接进行DART-MS检测。细胞样本的结果表明,DART-MS能够实现对仅约100个人类癌细胞中的DNA甲基化水平进行快速定量分析,并得到了与文献一致的结果。此外,我们验证了DART-MS方法的可靠性,并获得了令人满意的线性（R~2＞0.99）、精密度（＜10%）和准确度（80-120%）,且无需样品分离。与传统LC-ESI-MS相比,DART-MS方法对生物样品表现出更简便、更快速和更好的抗基质干扰能力,因此该方法在临床样品中DNA甲基化的高通量和灵敏分析方面具有巨大潜力。（2）基于电喷雾质谱（ESI-MS）、离子淌度质谱（IMS）和圆二色谱（CD）,分别探究了胞嘧啶第5号位碳原子的甲基化对于K-RAS启动子的富G序列（K-RAS Mid G）和腺嘌呤第6号位氮原子的甲基化对于K-RAS启动子的富G序列（K-RAS Near G）形成的G-四链体结构及性质的影响。研究结果表明,胞嘧啶甲基化（5-甲基化胞嘧啶）和腺嘌呤甲基化（N~6-甲基腺嘌呤）能够对K-RAS启动子区富G序列（K-RAS Near G和K-RAS Mid G）G-四链体的结构和性质产生不同程度的影响。这些结果为进一步了解DNA甲基化和突变对于G-四链体结构和性质的影响,进而调控相关基因生物学功能的抗癌策略具有重要意义。综上所述,本文开展了K-RAS相关基因富G序列的研究,发现胞嘧啶和腺嘌呤的甲基化都会一定程度上影响G-四链体的结构和性质。同时,还开发了一种实时直接快速分析细胞基因组DNA甲基化的质谱方法,成功实现了对于100个细胞量级中的DNA甲基化水平的定量分析。
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