苯是一种广泛使用的工业原料和常见的环境污染物。实验和流行病学证据都表明苯暴露可对机体健康造成损害,尤其是对造血系统的损害。尽管近年来通过生产工艺改进等方式,我国涉苯生产环境中苯暴露的水平已经大幅降低,但有证据表明长期低浓度的苯暴露也存在潜在的健康风险。低苯暴露产生的健康损害效应往往需要较长的时间才能体现,因此发现有效的早期损伤生物标志用于苯暴露的风险评价,对苯暴露的健康防护具有重大的公共卫生学意义。锌指基质蛋白型蛋白3（Zinc finger matrin-type protein 3,ZMAT3）是一种在进化上序列高度保守的锌指蛋白,序列的高度保守表明其可能具有重要的生物学功能。我们在前期研究工作中发现苯暴露小鼠的骨髓细胞中ZMAT3的转录水平异常增加,提示二者存在相关性,具有作为苯暴露风险评价的潜力,有进一步研究的价值。综上,本课题旨在探究ZMAT3表达的异常增加是否为造血系统损伤的表现,且这种变化在苯致造血系统损伤的过程中是否发挥了作用,以及是否可作为苯暴露的生物标志。考虑到ZMAT3绝大部分定位在细胞核,因此能否找到功能上与之相关的且更加便于检测的其他生物标记也是本课题的一个研究目标。由此我们首先构建了苯暴露小鼠模型,明确了苯暴露可诱导模型小鼠ZMAT3表达水平异常增加;生物信息学分析提示ZMAT3与TNF-α之间存在联系,进一步的实验在小鼠模型中确认了二者在苯暴露过程中表达的变化具有相关性;在此基础上,体外培养人脐带血造血干细胞,通过构建ZMAT3过表达和低表达的造血干细胞模型探索了ZMAT3对造血干细胞自我更新和早期分化的影响,同时检测干细胞模型中TNF-α的变化;通过构建ZMAT3过表达和低表达的K562细胞模型证明了ZMAT3参与TNF-α的调节,相较ZMAT3,TNF-α的检测更为简便,提示其应用潜能可能更大;最后通过职业流行学研究,探索了苯暴露对外周血白细胞中ZMAT3的转录水平以及血清中TNF-α含量的影响,评价二者是否具有作为苯暴露生物标志的潜力。一、ZMAT3在小鼠苯暴露后表达的时空规律的研究参照之前工作中的研究设计,采取皮下注射苯的方式构建小鼠苯暴露模型,检测外周血血常规评价模型构建的成功与否;分离外周血白细胞及骨髓细胞,检测小鼠外周血白细胞及骨髓细胞中ZMAT3表达的变化;荧光标记并通过流式细胞仪分选小鼠骨髓造血干细胞,之后检测ZMAT3在造血干细胞中表达的变化;生物信息学分析提示TNF-α与ZMAT3功能相关,因此通过ELISA及免疫组化检测了苯暴露小鼠TNF-α在外周血及骨髓中表达的变化。结果显示随苯暴露剂量的增加,小鼠外周血白细胞计数、红细胞计数以及血红蛋白浓度出现明显的下降;苯暴露小鼠骨髓细胞中ZMAT3表达水平会随着苯暴露剂量的增加而增加,而外周血白细胞中ZMAT3表达水平的变化不具有显著性;暴露组造血干细胞ZMAT3表达显著增加,相较于骨髓细胞和外周血白细胞,造血干细胞的m RNA水平变化幅度更大;对苯暴露小鼠TNF-α水平进行检测,发现苯暴露小鼠外周血血清TNF-α含量降低。综上,我们发现苯暴露会导致小鼠骨髓细胞尤其是骨髓造血干细胞内ZMAT3的表达出现异常的增加,过程中伴随着TNF-α表达的变化。二、ZMAT3影响人脐带血造血干细胞自我更新及早期分化的研究首先通过酶联免疫磁珠法分离脐带血造血干细胞并通过流式细胞仪检测造血干细胞的纯度;体外培养稳定后,通过慢病毒转染人脐带血造血干细胞构建ZMAT3过表达和低表达的体外造血干细胞模型;在此基础上通过流式分选转染阳性的造血干细胞并连续培养细胞21天,过程中于7、10、14和21天时荧光标记细胞表面CD34、CD38、CD19及CD33,通过流式细胞仪检测细胞表面分子表达和分布的变化;通过免疫荧光检测不同转染造血干细胞中NF-κB水平的差异;为探究造血干细胞ZMAT3表达变化是否可以通过造血微环境发挥进一步的影响,将低表达ZMAT3的造血干细胞及对应的NC组细胞分别与等量未转染造血干细胞混合进行14天共培养实验,ELISA检测共培养体系培养基中TNF-α含量,流式细胞仪检测未转染细胞表面CD19和CD33表达和分布的变化。研究结果显示,与对照组相比,ZMAT3过表达可显著降低造血干细胞的自我更新能力,但低表达ZMAT3对干细胞自我更新能力的增加有限;ZMAT3过表达和低表达都可以影响造血干细胞的早期分化,改变造血干细胞向髓系祖细胞和淋系祖细胞的分化过程;ZMAT3表达增加会引起造血干细胞内NF-κB激活;在造血干细胞共培养实验中,发现未转染的造血干细胞早期分化过程在不同转染类型细胞的影响下可以表现出差异,提示机体内部分造血干细胞ZMAT3表达的变化可能会通过造血微环境影响其他造血细胞的分化。三、ZMAT3参与TNF-α信号通路调节的研究慢病毒转染K562细胞,成功构建了ZMAT3过表达和低表达细胞株,随后通过细胞增殖实验及流式细胞仪检测K562细胞内ZMAT3表达变化对细胞增殖、周期和凋亡的影响;由于有文献报道ZMAT3与P53功能相关,因此我们检测了过氧化氢处理细胞后细胞凋亡的水平,探究ZMAT3与活性氧之间是否存在功能上的联系;通过ELISA检测细胞内TNF-α含量探索ZMAT3与TNF-α表达之间的关系;为探究ZMAT3与TNF-α是否具有功能上联系,给予50μM的TNF-α处理细胞,流式细胞仪检测TNF-α处理对细胞凋亡的影响,并通过蛋白印迹分析检测TNF-α处理后细胞内MAPK信号通路的变化;为进一步研究ZMAT3与TNF-α之间的调控关系,我们进行了免疫共沉淀实验,考马斯亮蓝染色后对蛋白丰度较高的15-25k D以及30-40k D的蛋白质胶条做了Maldi质谱分析;随后使用免疫共沉淀联用蛋白印迹分析检测了Heterogeneous nuclear ribonucleoproteins A2/B1（hnRNP A2/B1）和Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A1（hnRNP A1）与ZMAT3之间是否存在直接的相互作用;为了确认ZMAT3与hnRNP A2/B1的相互作用是否可以引起后者功能的改变,依托实时荧光定量PCR检测了细胞中hnRNP A2/B1靶标基因的表达情况;考虑有文献报道hnRNP A1可以通过与IKB-α结合间接影响TNF-α的表达,为此进一步通过免疫共沉淀探究了ZMAT3对于hnRNP A1及hnRNP A2/B1与IKB-α结合的影响。K562细胞内ZMAT3表达的变化对增殖、周期及凋亡的影响较小;ZMAT3表达变化对活性氧诱导的K562细胞凋亡影响不显著;ZMAT3过表达的细胞中检测到TNF-α表达量的显著增加,且给予TNF-α处理会使细胞凋亡增加,其原因是ZMAT3表达变化影响了MAPK信号通路的磷酸化,提示ZMAT3不仅可以影响细胞内TNF-α的表达,且与TNF-α有直接的生物学功能上的联系;Maldi质谱分析结果显示ZMAT3可能与hnRNP A2/B1、hnRNP A1、Histone H1-1以及Histone H4存在相互作用;蛋白印迹分析结果确认了ZMAT3与hnRNP A1和hnRNP A2/B1存在相互作用;ZMAT3表达的变化可以引起hnRNP A1和hnRNP A2/B1靶标基因表达的变化,表明ZMAT3可以通过影响后两者参与调节TNF-αmRNA的加工;hnRNP A1和hnRNP A2/B1可以与IKB-α结合维持NF-κB的激活状态,但ZMAT3与hnRNP A1和hnRNP A2/B1的相互作用不影响后两者与IKB-α的结合。四、ZMAT3与TNF-α作为苯暴露人群潜在生物标志物可能性的研究采用横断面研究,以2017年7月至2018年6月扬州当地企业18-55岁的体检职工为研究对象,收集年龄、性别、工龄、吸烟与否、饮酒与否、环境苯暴露与否等流行病学资料,纳入血常规未见异常的苯暴露工人血样100份和对照组（非苯暴露）血样100份,分析二者白细胞中ZMAT3的mRNA水平的差异;结果显示苯暴露组工人白细胞ZMAT3表达水平与对照组的差异不具有显著性（p=0.051）,这可能是因为外周血白细胞自身敏感性低于骨髓细胞和造血干细胞以及暴露组中存在的健康工人效应导致的,因此考虑到实际应用的需要,检测外周血白细胞ZMAT3 mRNA可能不适宜作为苯暴露的生物标记。以2018年7月至2019年6月扬州当地企业35-55岁的体检职工为研究对象,收集年龄、性别、工龄、吸烟与否、饮酒与否、环境苯暴露与否等流行病学资料,纳入血常规未见异常的非吸烟非饮酒人群,共收集环境苯暴露工人血清样本64份和对照人群血清样本74份,通过ELISA检测血清样本中TNF-α的含量;结果显示暴露组血清TNF-α含量显著高于对照组（p=0.028）,因此具有作为苯暴露生物标记物的潜能,有进一步研究的价值,但是由于TNF-α在人群血清中含量波动较大,因此采用连续监测血清TNF-α含量的数据可能应用价值更大。总结研究通过构建苯暴露小鼠模型,发现苯暴露小鼠骨髓细胞ZMAT3表达异常增加,且造血干细胞在这一过程中表现得更为敏感;而且苯暴露可诱导TNF-α表达发生变化。慢病毒体外转染人脐带血造血干细胞模型的结果表明ZMAT3表达的增加会严重损伤造血干细胞的自我更新能力,并激活细胞内NF-κB信号通路;ZMAT3表达的变化会影响造血干细胞的早期分化过程和TNF-α的合成释放,且可以通过共培养体系进一步影响到其他造血干细胞的早期分化。K562细胞内ZMAT3表达变化对细胞增殖、周期和凋亡的影响有限,且并不改变K562细胞对氧化应激的反应性;ZMAT3过表达可以增加细胞内TNF-α的表达,且增加K562细胞对TNF-α的反应性。免疫共沉淀结果显示ZMAT3可能通过hnRNP A1和hnRNP A2/B1参与对TNF-α表达的调控。最后通过分析人群血液样本的数据发现外周血白细胞ZMAT3表达量的变化不显著,但外周血TNF-α含量有显著性变化,后者有作为苯暴露的生物标志的潜力;由于实验样本有限,后续应进一步扩大样本量继续研究。