第一章:Ⅱ型跨膜丝氨酸蛋白酶TMPRSS2活化机制研究研究目的:跨膜丝氨酸蛋白酶 2（Transmembrane serine proteinase 2,TMPRSS2）是一种Ⅱ型跨膜丝氨酸蛋白酶,广泛分布于呼吸道、胃肠道和泌尿生殖道。TMPRSS2参与前列腺癌的发生发展,介导了多种病毒入侵人体细胞的过程,与目前正在全球范围内大流行的新冠肺炎的发生密切相关。如同其它Ⅱ型跨膜丝氨酸蛋白酶,TMPRSS2也是以酶原形式合成,需要活化后才能发挥作用。迄今,TMPRSS2活化的分子机制尚不完全明了。在本章节中,我们将致力于研究TMPRSS2在细胞中活化的分子机制,包括探究其在细胞内的活化方式和活化位置。研究方法:1.构建人野生型（Wild-type,WT）TMPRSS2表达载体,在羧基端加上V5标签;2.以WTTMPRSS2表达载体为模板、通过定点突变技术构建裂解位点突变体R292A和酶活性位点突变体S478A;3.将构建好的质粒转染HEK293细胞、人肺泡腺癌基底上皮细胞A549细胞及支气管上皮样细胞16HBE细胞。用蛋白免疫印迹法（Western blotting）、流式细胞术（Flow cytometry）、免疫荧光技术、生物素标记膜蛋白（Biotin labeling）以及小分子荧光底物活性实验检测TMPRSS2及其突变体在细胞裂解液及细胞膜表面的表达和活化情况;4.为检测TMPRSS2在细胞中的活化位置,分别用胰蛋白酶（Trypsin）、布雷菲德菌素A（brefeldinA,BFA）和莫能菌素（Monensin）处理表达TMPRSS2的HEK293细胞,裂解细胞后,用Western blotting检测细胞裂解液中TMPRSS2的表达与活化情况。研究结果:1.用Western blotting分析转染WT TMPRSS2后的HEK293细胞,在非还原条件下,能够检测到一条～65 kDa条带。还原条件下,检测到一条～65 kDa的酶原条带和一条～31 kDa的活化蛋白酶条带。这些结果表明,TMPRSS2能够在HEK293细胞中发生活化;2.Western blotting结果显示,在还原条件下,在HEK293、16HBE及A549细胞中转入TMPRSS2突变体R292A与S478A后,仅检测到一条～65 kDa的条带,～31 kDa的活化条带未见。小分子荧光底物孵育实验表明WTTMPRSS2具有酶活性,而突变体R292A与S478A则没有酶活性。结果提示,TMPRSS2的活性位点位于R292,并且活化过程依赖其自身酶活性;3.通过免疫荧光、流式细胞术及生物素标记膜蛋白,用V5抗体检测发现WT与无活性突变体R292A与S478A不同,HEK293细胞膜上检测不到WT TMPRSS2蛋白。用抗TMPRSS2抗体检测,显示WT及其突变体在HEK293、A549及16HBE细胞膜上表达,提示WT TMPRSS2活化后会将其羧基端的V5标签切除,而突变体R292A与S478A则没有这种自身切割的现象;4.胰蛋白酶消化和Western blotting实验结果显示,Trypsin处理前后的HEK293细胞中均能检测到～31 kDa的蛋白酶条带,表明TMPRSS2的活化发生在细胞内;5.Monensin及BFA处理表达TMPRSS2的细胞后,经Western blotting检测发现,Monensin处理后依然可检测到TMPRSS2的活化条带,而BFA处理后TMPRSS2的活化受到抑制。结果提示,TMPRSS2的活化不在内质网,而在内质网之后的细胞转运至细胞膜的过程中,很可能是在高尔基体。结论:我们的结果表明,TMPRSS2是通过自我切割的方式活化的,TMPRSS2的活化发生在细胞内质网之后的转运过程,很可能是在高尔基体。第二章:肝细胞生长因子激活物抑制因子及N-糖基化修饰对TMPRSS2活化的影响研究目的:TMPRSS2作为一种丝氨酸蛋白酶,在甲型流感病毒、SARS-CoV、MERS-CoV以及SARS-CoV-2感染细胞的过程发挥重要的作用。因此,对TMPRSS2酶活性的调控机制研究对于病毒感染防治有较为重要的意义。肝细胞生长因子激活物抑制因子（Hepatocyte growth factor activator inhibitor 1和2,HAI-1和HAI-2）是人体内表达较为广泛的蛋白酶抑制剂,可以抑制多种蛋白酶的活性。N-糖基化是常见的蛋白翻译后修饰,在蛋白结构和功能调控中发挥作用。本章节中,我们将探究HAI-1和HAI-2,以及N-糖基化对TMPRSS2活化及转运的影响。研究方法:1.将肝细胞生长因子激活物抑制因子HAI-1、HAI-2与TMPRSS2质粒共转入HEK293细胞,通过Western blotting检测HAI-1、HAI-2是否可以影响TMPRSS2的活化;2.用糖苷酶PNGase F处理表达TMPRSS2的细胞裂解液,通过Western blotting检测TMPRSS2蛋白的N-糖基化情况;3.以WTTMPRSS2表达载体为模板,通过定点突变技术,构建N-糖基化位点突变体N250Q、N286Q和N250Q/N286Q质粒;4.将构建好的质粒转染HEK293细胞,使用Western blotting检测WT及N-糖基化位点突变体在HEK293细胞中的表达及活化情况,探究TMPRSS2的N-糖基化情况以及N-糖基化对TMPRSS2活化的影响;5.用放线菌酮（Cycloheximide,CHX）处理表达WTTMPRSS2及N-糖基化突变体的HEK293细胞,在不同时间点收集细胞,制备裂解液,使用Western blotting检测蛋白表达情况,计算蛋白半衰期;6.免疫荧光检测WT TMPRSS2及突变体N250Q、N286Q和N250Q/N286Q在HEK293细胞中与内质网标志物KDEL和高尔基体标志物GM130的共定位情况。研究结果:1.Western blotting检测分析丝氨酸蛋白酶抑制剂与TMPRSS2质粒共转染的HEK293细胞样品,结果显示,在HAI-1、HAI-2与TMPRSS2共转染的细胞样品中,相比对照组,TMPRSS2的活化条带明显减少。该结果提示,HAI-1、HAI-2均可以抑制TMPRSS2的自我活化作用;2.用糖苷酶 PNGase F 处理后,Western blotting 结果显示,WTTMPRSS2的迁移变快,表明TMPRSS2存在N-糖基化修饰;3.Western blotting检测结果显示,与WT相比,N-糖基化位点突变体迁移加快,表明TMPRSS2在N250和N286处各有一个N-糖基化。另外N250Q与N250Q/N286Q未检测到活化条带,而N286Q与WT类似,可以检测到活化带。结果表明,N250位置N-糖基化的缺失会使TMPRSS2不能发生活化;4.通过免疫荧光分析WT及其N-糖基化位点突变体在细胞中的定位,发现N250Q和N250Q/N286Q与内质网有明显共定位,而WT和N286Q则没有检测到与内质网的共定位。这表明N250位N-糖基化的缺失会使TMPRSS2滞留于内质网,从而使其不能发生活化,N286位N-糖基化的缺失则基本不会影响TMPRSS2在细胞内的活化和转运。结论:我们的结果表明,蛋白酶抑制剂HAI-1和HAI-2可以抑制TMPRSS2的活化;TMPRSS2第250位的N-糖基化修饰对蛋白转运和活化至关重要,缺失会导致TMPRSS2滞留于内质网,且不能发生活化。第三章:TMPRSS2切割新型冠状病毒刺突蛋白的机制研究研究目的:TMPRSS2是一种分布于鼻、支气管及肺等呼吸器官上皮细胞的跨膜丝氨酸蛋白酶。可裂解冠状病毒表面的刺突（Spike,S）蛋白,从而参与冠状病毒感染宿主细胞的过程。TMPRSS2有两种剪切异构体,TMPRSS2异构体1相较于TMPRSS2异构体2具有更长的胞质段。目前关于TMPRSS2的研究主要集中在异构体2,有关TMPRSS2异构体1的报道甚少,关于TMPRSS2切割Spike蛋白的分子机制,如具体的切割位点等,也没有完全明确。本章节中,我们采用TMPRSS2 异构体 1（WT）的表达载体,研究 TMPRSS2 对 SARS-CoV-2 Spike蛋白的切割作用及具体分子机制。研究方法:1.将SARS-CoV-2 Spike蛋白表达质粒转入HEK293细胞,用免疫印迹检测其表达情况;2.将TMPRSS2与Spike蛋白表达质粒共转入细胞,通过免疫印迹检测TMPRSS2对Spike蛋白的切割作用;3.构建Spike蛋白S1/S2切割位点、S2’切割位点突变的突变体S1/S2 mut（mutant）、S2’ mut及两个位点同时突变的突变体S1/S2-S2’ mut,然后将这些质粒分别与TMPRSS2共转入HEK293细胞,探究TMPRSS2切割Spike蛋白的机制。研究结果:1.Western blotting 分析转染 SARS-CoV-2 Spike 表达质粒的 HEK293 细胞,检测到～207 kDa的全长Spike蛋白条带,～92 kDa的S2片段,以及大分子量的Spike蛋白聚合物条带,提示SARS-CoV-2 Spike表达质粒可以在HEK293细胞中表达;2.将TMPRSS2与Spike共转入HEK293细胞,可以检测到约68 kDa的S2’条带。提示在HEK293细胞内TMPRSS2可以在S2’位置切割Spike蛋白产生S2’片段;3.将TMPRSS2与WT Spike及突变体共转,Western blotting结果显示:全长Spike蛋白都可以检测到,S1/S2 mut检测不到S2片段,S2’ mut及S1/S2-S2’ mut无论TMPRSS2存在与否,均检测不到S2及S2’片段。结果提示,S2’位点对Spike蛋白的切割至关重要,此位点突变不仅影响TMPRSS2对Spike蛋白的切割,也影响Spike蛋白S1/S2位点的切割。结论:我们证明了 TMPRSS2异构体1可以在S2’位点切割活化SARS-CoV-2的Spike蛋白,并且只有Spike蛋白在S2’位点可以被切割时,S1/S2裂解位点才能被切割。鉴于Spike蛋白的S1/S2及S2’裂解位点在SARS-CoV-2感染中的重要性,这些发现为TMPRSS2在SARS-CoV-2感染中的作用提供了新的见解。