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背景:类风湿关节炎（rheumatoid arthritis,RA）是一种常见的慢性自身免疫病,B细胞及其产生的自身抗体在RA发病中发挥着关键作用。研究表明,RA患者及胶原诱导关节炎（collagen-induced arthritis,CIA）动物模型体内B细胞存在异常活跃及分化、分泌功能异常。组蛋白乙酰化修饰是一种典型的表观遗传学调控方式,组蛋白乙酰化水平受组蛋白乙酰转移酶（histone acetyltransferases,HATs）和组蛋白去乙酰化酶（histone deacetylases,HDACs）共同调控,正常情况下处于动态平衡状态。多项研究表明,RA患者体内存在HDACs水平失调,HDACs抑制剂（histone deaceylase inhibitors,HDACIs）对多种自身免疫病具有治疗作用。目前,RA患者外周血B细胞中HDACs水平是否失调尚无相关研究。间充质干细胞来源的外泌体（mesenchymal stem cells derived exosomes,MSC-Exos）是MSCs分泌的小囊泡,不仅具有母体细胞的免疫调节作用,还可规避活体注射干细胞带来的不良风险。本课题组前期研究发现,人脐带MSC-Exos（human umbilical cord MSC-Exos,h UCMSC-Exos）可改善CIA大鼠关节症状及影像学表现,下调促炎因子及趋化因子的水平,下调RA患者滑膜成纤维细胞中HDAC1的表达。h UCMSC-Exos对RA患者外周血B细胞中HDACs水平的影响尚无研究。本课题旨在探究RA患者外周血B细胞中HDACs水平是否失调及h UCMSC-Exos对RA患者外周血B细胞功能及HDACs水平的影响。目的:1.探究RA患者外周血B细胞功能是否存在异常及组蛋白乙酰化水平是否失调;2.探究hUCMSC-Exos对RA患者外周血B细胞凋亡、分化、分泌细胞因子及免疫球蛋白的影响;3.探究h UCMSC-Exos对RA患者外周血B细胞HDAC总活性、HDAC1-3亚型表达水平的影响。方法:1.样本制备:（1）B细胞的分离及鉴定:经医院伦理委员会批准,采集健康人及活动期RA患者外周血,密度梯度离心法分离出PBMCs,利用CD19磁珠分选出CD19+B细胞并用流式细胞术鉴定其纯度。（2）h UCMSCs的分离及鉴定:收集足月新生儿的脐带组织,组织贴壁法获取原代h UCMSCs并用流式细胞术鉴定其表面标记。（3）h UCMSC-Exos的分离及鉴定:采用差速离心法联合超滤法获取h UCMSC-Exos,并用透射电镜、纳米颗粒跟踪分析法及免疫印迹法（Western Blot）对其进行鉴定。2.比较健康对照组与RA患者组B细胞功能及组蛋白乙酰化水平:流式细胞术检测B细胞凋亡率、浆母细胞及调节性B细胞（regulatory B cells,Bregs）比例;HDAC活性荧光分析试剂盒检测B细胞HDAC总活性;RT-q PCR检测B细胞中HDAC1、HDAC2、HDAC3 m RNA水平。3.比较不同干预组对RA患者B细胞功能及HDACs水平的影响:（1）实验分组:分为4组:空白对照组、h UCMSCs干预组、h UCMSC-Exos干预组、曲古抑菌素A（Trichostatin A,TSA）干预组。（2）检测方法:（1）流式细胞术检测各组B细胞凋亡率、浆母细胞及Bregs比例;（2）流式多因子检测技术检测各组上清液中TNF-α、IL-6、IL-8水平;（3）酶联免疫吸附试验（ELISA）检测各组上清液中Ig G、Ig A、Ig M水平;（4）HDAC活性荧光分析试剂盒检测各组B细胞HDAC总活性;（5）RT-q PCR检测各组B细胞中HDAC1、HDAC2、HDAC3 m RNA表达水平。结果:1.样本制备:（1）B细胞的鉴定:流式细胞术检测CD19+B细胞纯度为97.71%。（2）h UCMSCs的分离及鉴定:原代脐带组织在培养10-12天时观察有梭形细胞从组织边缘爬出。流式细胞术鉴定其表面标记CD105、CD90、CD73、CD44、CD29呈阳性,CD34、CD14、HLA-DR呈阴性,符合国际MSCs的定义标准。（3）h UCMSC-Exos的分离及鉴定:透射电镜下发现h UCMSC-Exos为直径在30-150nm之间的膜性囊泡;纳米颗粒跟踪分析显示h UCMSC-Exos粒径峰值为122.8nm左右;Western Blot鉴定h UCMSC-Exos表达CD9、CD63、CD81,均符合外泌体标准。2.健康对照组与RA患者组B细胞功能及HDACs水平的比较:（1）与健康对照组相比,RA患者B细胞凋亡率降低,浆母细胞比例升高,Bregs比例显著降低,差异均有统计学意义（P＜0.05）;（2）与健康对照组相比,RA患者B细胞胞核HDAC总活性水平升高,差异有统计学意义（P＜0.05）,胞质HDAC总活性水平差异无统计学意义（P＞0.05）,HDAC1 m RNA表达水平降低,HDAC2、HDAC3 m RNA表达水平升高,差异有统计学意义（P＜0.05）;3.h UCMSC-Exos对RA患者B细胞功能的影响:（1）h UCMSC-Exos对RA患者B细胞凋亡率的影响:与空白对照组相比,h UCMSCs、h UCMSC-Exos干预组B细胞凋亡率升高,差异有统计学意义（P＜0.05）,TSA干预组B细胞凋亡率升高,但尚未达到统计学差异（P＞0.05）,h UCMSCs、h UCMSC-Exos及TSA干预组三组之间差异无统计学意义（P＞0.05）。（2）h UCMSC-Exos对RA患者B细胞分化的影响:（1）h UCMSC-Exos对RA患者B细胞分化为浆母细胞的影响:与空白对照组相比,h UCMSCs、h UCMSC-Exos、TSA干预组浆母细胞比例降低,差异有统计学意义（P＜0.05）,h UCMSCs、h UCMSC-Exos及TSA干预组三组之间差异无统计学意义（P＞0.05）。（2）h UCMSC-Exos对RA患者B细胞分化为Bregs的影响:与空白对照组相比,TSA干预组Bregs比例升高,差异有统计学意义（P＜0.05）,hUCMSC-Exos干预组Bregs比例升高,但尚未达到统计学差异（P＞0.05）,h UCMSCs干预组差异无统计学意义（P＞0.05）,与h UCMSCs干预组相比,TSA干预组Bregs比例显著升高（P＜0.05）。（3）h UCMSC-Exos对上清液中细胞因子水平的影响:（1）与空白对照组相比,h UCMSCs、h UCMSC-Exos干预组上清液中TNF-α水平显著降低（P＜0.05）,TSA干预组差异无统计学意义（P＞0.05）,与TSA干预组相比,h UCMSCs干预组TNF-α水平降低,差异有统计学意义（P＜0.05）。（2）与空白对照组相比,h UCMSCs、h UCMSC-Exos、TSA干预组上清液中IL-6水平显著降低（P＜0.05）,h UCMSCs、h UCMSC-Exos及TSA干预组三组之间差异无统计学意义（P＞0.05）;（3）与空白对照组相比,h UCMSCs、h UCMSC-Exos、TSA干预组上清液中IL-8水平降低（P＜0.05）,与h UCMSCs、h UCMSC-Exos干预组相比,TSA干预组IL-8水平降低,差异有统计学意义（P＜0.05）。（4）h UCMSC-Exos对上清液中免疫球蛋白水平的影响:（1）与空白对照组相比,h UCMSCs、h UCMSC-Exos干预组上清液中Ig G水平显著降低（P＜0.05）,TSA干预组差异无统计学意义（P＞0.05）,与TSA干预组相比,h UCMSCs干预组Ig G水平降低,差异有统计学意义（P＜0.05）;（2）与空白对照组相比,h UCMSCs、h UCMSC-Exos、TSA干预组上清液中Ig A水平降低,差异有统计学意义（P＜0.05）,h UCMSCs、h UCMSC-Exos及TSA干预组三组之间差异无统计学意义（P＞0.05）;（3）与空白对照组相比,TSA干预组上清液中Ig M水平显著降低（P＜0.05）,h UCMSCs、h UCMSC-Exos干预组差异无统计学意义（P＞0.05）,与h UCMSCs、h UCMSC-Exos干预组相比,TSA干预组Ig M水平降低,差异有统计学意义（P＜0.05）。4.h UCMSC-Exos对RA患者B细胞HDACs水平的影响:（1）h UCMSC-Exos对RA患者B细胞HDAC总活性的影响:与空白对照组相比,h UCMSCs、h UCMSC-Exos、TSA干预组B细胞胞核HDAC总活性水平显著降低（P＜0.05）,h UCMSCs、h UCMSC-Exos及TSA干预组三组之间差异无统计学意义（P＞0.05）。（2）h UCMSC-Exos对RA患者B细胞HDAC1、HDAC2、HDAC3 m RNA表达水平的影响:与空白对照组相比,h UCMSCs、h UCMSC-Exos干预组B细胞HDAC1 m RNA水平升高,差异有统计学意义（P＜0.05）,TSA干预组差异无统计学意义（P＞0.05）;与TSA干预组相比,h UCMSCs、h UCMSC-Exos干预组HDAC1 m RNA水平显著升高（P＜0.05）,h UCMSCs、h UCMSC-Exos、TSA干预组B细胞HDAC2、HDAC3 m RNA水平显著降低（P＜0.05）,三组之间比较差异无统计学意义（P＞0.05）。结论:1.RA患者B细胞中存在凋亡、分化功能异常及HDACs水平表达失调。RA患者B细胞凋亡率及Bregs比例降低,浆母细胞比例升高,HDAC总活性及HDAC2、HDAC3水平升高,HDAC1水平降低;2.h UCMSC-Exos可改善B细胞凋亡、分化及分泌功能的异常。h UCMSC-Exos可促进RA患者B细胞凋亡,降低浆母细胞比例,降低炎性细胞因子TNF-α、IL-6、IL-8及免疫球蛋白Ig G、Ig A水平,且作用与母体细胞相当;3.h UCMSC-Exos可调节B细胞HDACs水平的紊乱。h UCMSC-Exos可降低RA患者B细胞HDAC总活性及HDAC2、HDAC3水平,升高HDAC1水平,且作用与母体细胞相当。