肝脏是机体的一个重要器官,参与机体的消化、吸收、解毒、物质合成和代谢、免疫防御等过程,被形象的称为机体的"加工厂"。肝脏对由消化道吸收来的营养物质的代谢作用一直是科学家研究的焦点。然而,肝脏对由消化道转移来的异常代谢产物的免疫防御作用的研究没有受到足够的重视。本文以装有瘤胃瘘管和肝脏慢性多血管瘘的山羊和奶牛为试验动物,研究在高精料日粮诱导的亚急性瘤胃酸中毒(SARA)状态下,肝脏对消化道转移来的LPS的清除效率,以及这些LPS对肝脏天然免疫反应的影响,并揭示相关表观遗传机理。最后通过乳腺接种E.coli的试验进一步揭示肝脏中天然免疫基因表达过程中所发生的表观遗传修饰。1.消化道来源的LPS在山羊肝脏中的清除效率及其对肝脏免疫功能的影响肝脏对SARA状态下由消化道转移来的LPS的清除效率以及肝脏对这些LPS产生的免疫防御反应报道很少。本试验中12只母波杂羊被随机分为两组,第一组饲喂高精料日粮(精:粗=6:4,n=6)诱导SARA作为处理组;第二组饲喂低精料日粮(精:粗=4:6,n=6)作为对照组。所有山羊均安装瘤胃瘘管和门静脉、肝静脉、股动脉以及肠系膜静脉血管插管。饲喂3周后,处理组中瘤胃pH<5.6且持续时间>3 h/d,说明SARA被成功诱发。饲喂6周之后,处理组中血流量和LPS的浓度在门静脉、肝静脉以及动脉中均显著升高。肝脏的净清除速率和清除比例统计结果显示LPS清除速率显著增加(5.46 EU/sec vs 2.83 EU/sec;处理组vs对照组),但是其清除比例却降低(10.57%vs18.27%;处理组vs对照组),说明高精料日粮诱导的SARA引起活性LPS在肝脏内的蓄积。处理组山羊外周血液中促炎症细胞因子IL-1β(P<0.01)和TNF-α(P<0.01)以及急性期蛋白LBP(P<0.01)、Hp(P=0.02)和SAA(P=0.02)浓度与对照组相比显著升高,说明SARA可引起系统性的炎症反应。另外,外周血液中生化指标ALT(P<0.01)、ALP(P<0.01)和T-BIL(P<0.01)的浓度处理组中显著高于对照组,说明SARA状态下肝细胞的受到损伤。肝脏中免疫相关基因和TLR4蛋白的表达结果说明,高精料诱导的SARA使肝脏的免疫防御能力增强。本试验研究表明,高精料日粮诱导的SARA导致消化道来源的LPS在肝脏中蓄积、外周血液中促炎症细胞因子和急性期蛋白浓度升高,以及肝脏中免疫相关基因和TLR4蛋白表达显著增强,从而提高了LPS在肝脏中的清除速率。然而,大量活性LPS的蓄积和过多细胞因子的产生导致了肝细胞受损,减弱了肝脏对LPS的清除能力,降低了LPS在肝脏中的清除比例。2.消化道来源的LPS对奶山羊肝脏中TLR4信号通路及其下游免疫基因表达的影响饲喂高精料日粮诱导的SARA可引起系统性炎症反应,这种炎症反应极有可能是被由消化道转移进入循环系统的LPS引起的。本试验研究的目的是揭示循环系统中LPS浓度增加与肝脏炎症反应之间的因果关系。选用8只泌乳中期萨能奶山羊,安装瘤胃瘘管及门静脉血管插管,并随机分配到饲喂高精料日粮(精:粗=6:4,n=4)的处理组(Treatment)和饲喂低精料日粮(精:粗=4:6,n=4)的对照组(Control)。处理组中瘤胃pH低于5.6的持续时间从第4周开始超过180min,说明SARA被成功诱发。8周之后,高精料日粮饲喂显著降低了瘤胃pH、乳产量、乳脂率和乳糖,增加了瘤胃和门静脉中LPS的浓度。mRNA定量结果显示,高精料诱导的SARA导致肝脏中天然免疫基因的表达被增强。Western blotting结果显示,肝脏中TLR4、NF-κB p65和磷酸化p65蛋白的量在处理组中显著高于对照组。CHART-PCR和DNA甲基化分析发现SARA状态下消化道来源的LPS显著降低了肝脏中TLR4基因启动子区域染色质压缩程度和DNA甲基化率。本试验研究表明,高精料日粮诱导的SARA导致大量的LPS由消化道转移经门静脉进入肝脏,降低了TLR4启动子区域染色质压缩程度和DNA甲基化率,从而增强了肝脏中TLR4基因和蛋白的表达,激活了TLR4信号传导通路,上调了天然免疫基因的表达,引起了肝脏的炎症反应。因此,SARA状态下肝脏中免疫基因表达增强受表观遗传机制的调控,为治疗SARA引起的系统性炎症反应开辟了一个新的途径。3.消化道来源的LPS对奶牛肝脏中天然免疫基因表达的影响极其表观机理的研究当免疫基因受到炎性因子刺激时,表观遗机制在其表达过程中起到至关重要的作用。饲喂高精料日粮给奶牛引起的SARA可导致系统性炎症反应已经被广泛报道,然而奶牛肝脏中天然免疫基因的表达调控是否与表观遗传机制有关还不清楚。本试验研究选用8头装有瘤胃瘘管以及肝静脉和门静脉血管插管的泌乳中期奶牛,被随机安排到饲喂高精料日粮(精:粗=6:4,n=4)的处理组中(Treatment),或者饲喂低精料日粮(精:粗=4:6,n=4)的对照组中(Control)。饲喂高精料日粮导致瘤胃pH<5.6的持续时间大于180 min/d从4周之后出现,说明SARA被成功诱发。饲喂10周之后,处理组中,瘤胃、门静脉和肝静脉中LPS的浓度显著高于对照组。饲喂高精料日粮诱导的SARA导致免疫相关基因的表达显著升高。免疫候选基因(TLR4、LBP、Hp和SAA3)启动子区域的染色质压缩程度和DNA甲基化率在处理组中显著低于对照组。相关性分析显示免疫候选基因启动子区域染色质状态与相应基因的表达呈极强的负相关,与DNA甲基化水平呈正相关。本研究揭示了饲喂高精料日诱导的奶牛的SARA导致大量LPS从消化道转移经门静脉进入肝脏,降低了免疫基因启动子区域DNA甲基化率,使该区域染色质呈疏松状态,进而增强肝脏免疫相关基因的表达。这一研究为生产实践中通过使用表观调节因子来保护患SARA奶牛的健康,维持生产性能提供了理论依据。4.乳腺接种E.coli对奶牛肝脏免疫基因表达的影响及表观机理研究LPS是由革兰氏阴性菌裂解释放出来的,当机体受到这种细菌感染时,它可以导致TLR信号通路过渡激活,最终引起严重的全身反应。本试验的目的是研究表观遗传学机制是否参与了这种全身反应的发生和发展过程。选用16头泌乳中期奶牛随机分为三组,第一组接种E.coli到右前、右后和左后三个乳区作为试验一(HeavilyInfected,n=4),第二组接种E.coli到右后乳区作为试验二(Gently Infected,n=7),第三组几种等量的生理盐水到右后乳区作为对照组(Control)。接种24h后屠宰采取肝脏样品。CHART-PCR的结果显示,乳腺接种E.coli 24 h之后导致奶牛肝脏中免疫基因(TLR4、TLR2、LBP和Hp)启动子区域染色质结构呈疏松状态,并且mRNA的表达量增强。然而,在αS1-casein基因启动子区域染色质结构无论是在试验组还是对照组均呈疏松状态,接种E.coli没有引起像免疫基因启动子区域染色质的结构变化。DNA甲基化分析结果显示,TLR4启动子区域甲基化率的降低与其染色质的疏松程度极其相关。本试验结果表明乳腺接种E.coli可导致肝脏中天然免疫基因表达增强,表观遗传机制参与调控了它们的表达。这个结论为我们表观遗传机制可能是处理这些疾病的一个新措施。