肿瘤来源外泌体（Exosomes,Exos）在肿瘤的发生发展、肿瘤转移、免疫反应抑制、血管生成等生理过程发挥重要作用,因此,对肿瘤外泌体的分析和检测将有助于肿瘤的早期诊断、疗效评估和预后分析。然而,目前已发展的肿瘤外泌体检测方法仍存在灵敏度低、特异性不强、准确度差、成本高等亟待解决的诸多关键科学问题。本文以发展肿瘤外泌体高灵敏、高特异性和高准确性的检测新方法为目标,利用DNA碱基互补配对原则和双螺旋特性可组装特定功能及几何结构的能力构建了一系列新型DNA纳米探针,结合具有响应速率快、信号转换灵敏特性的粘性末端（Toehold）介导的链置换反应,同时引入核酸适配体（Aptamer）为特异性识别探针,分别以乳腺癌、人急性白血病和肝癌为研究对象,选择肿瘤外泌体核酸micro RNA（mi RNA）及其表面蛋白标志物为模式靶标,深入开展了肿瘤外泌体的高灵敏、高特异性和高准确性检测及其临床应用研究。具体包括以下几个方面工作:一、基于Y型DNA纳米探针和DNA链置换的乳腺癌外泌体mi RNAs原位多重检测基于单靶标检测准确性不足和需要RNA提取等问题,利用DNA碱基互补配对原则将末端修饰淬灭基团的三条DNA单链自组装成Y型DNA纳米结构为支架（作为识别基元）,同时将三种报告探针（作为信号基元）组装于Y型支架上,成功发展了一种自淬灭DNA纳米探针。当探针进入外泌体内,一旦与靶标mi RNA结合,即可触发DNA链置换反应,释放报告探针,此时荧光恢复,实现外泌体内mi RNA原位多重无损检测。以乳腺癌（MCF-7）外泌体中高度表达的mi R-21,mi R-27a和mi R-375为模式靶标,实验结果表明,不同于人正常乳腺（MCF-10A）外泌体,当探针与MCF-7外泌体孵育后,MCF-7外泌体产生的荧光强度与其浓度呈正相关性,通过测量MCF-7外泌体中三种mi RNAs（mi R-21,mi R-27a和mi R-375）的表达水平,对外泌体的检测限分别为0.116μg/m L、0.125μg/m L和0.287μg/m L。同时,该探针还能以高选择性实现混合样品的检测。通过分析临床血浆外泌体中三种mi RNAs的表达水平,该方法能实现乳腺癌患者的诊断与区分,具有准确性高和特异性强的优势,有望为肿瘤早期诊断研究提供更精确信息。二、基于Aptamer识别的三维多足DNA步行器和催化发夹组装的人急性白血病外泌体检测针对外泌体表面蛋白标志物在肿瘤早期阶段可能由于其丰度太低而无法被检测的问题,利用DNA步行器信号放大策略,结合具有特异性识别性能的Aptamer,以微米级琼脂糖微珠作为三维轨道,成功构建了一种基于Aptamer识别的三维多足DNA步行器。当Aptamer探针特异性识别外泌体表面的靶蛋白后,可自组装形成以外泌体为核心的多足DNA步行器,触发催化发夹组装（CHA）反应,在此驱动下DNA步行器沿着轨道不断行走,从而结合大量荧光信号,实现肿瘤外泌体的灵敏检测。以人急性白血病（CCRF-CEM）外泌体表面高表达的酪氨酸蛋白激酶7（PTK7）和靶向PTK7蛋白的Aptamer为模型,实验结果表明,该探针能实现靶标外泌体的高灵敏检测,信噪比可达23,检测限为1 particle/μL,是非催化反应的66倍。与此同时,该方法能以高特异性实现混合体系检测,还能在5%超速离心的胎牛血清中实现靶标的定量检测（检测限为3 particles/μL）,且在60%超速离心的血清样中对靶标的检测具有较好回收率（79.31%～98.71%）。通过改变Aptamer种类,DNA步行器可实现乳腺癌（MCF-7）外泌体表面MUC1粘蛋白检测,具有很好的通用性。根据病人血浆外泌体表面PTK7蛋白表达水平,该探针还可准确鉴别白血病患者和淋巴瘤患者,进一步证实PTK7蛋白标志物在白血病临床诊断中的潜力,因此有望为开发肿瘤早期临床诊断新方法提供新思路。三、基于Aptamer识别和催化发夹组装的轨道自助型三维DNA步行器与肝癌外泌体检测为了克服传统DNA步行器存在的操作复杂、行走效率不高、灵敏度不够等问题,以外泌体作为三维轨道,利用其表面的磷脂双分子层具有锚定胆固醇修饰催化发夹链的性能,结合具有特异性识别性能的裂开型Aptamer,构建了一种基于Aptamer识别和催化发夹组装的轨道自助型三维DNA步行器。当肿瘤外泌体存在时,裂开型Aptamer探针能特异性识别其表面靶蛋白并发生聚集组装,此时诱导两条裂开型触发序列靠近形成完整触发链,触发CHA反应,从而驱动DNA步行器不断行走,产生荧光共振能量转移（FRET）信号,实现肿瘤外泌体免洗、高灵敏检测研究。以肝癌（SMMC-7721）外泌体表面特异性表达的糖蛋白N-乙酰半乳糖胺（Gal NAc）为研究对象,实验结果表明,相比于对照探针（没有胆固醇修饰）,DNA步行器行走效率明显提升,在60 min内能实现靶标快速响应,这可能是由于外泌体表面磷脂双分子层的流动性增加了探针局域反应浓度。抗酶切和抗干扰实验表明,利用外泌体来锚定发夹能显著提高探针的抗酶切能力,同时采用FRET策略能够保证探针有效避免DNA酶和血清样中化学物质引起的假阳性信号。得益于裂开型触发链的低背景优势和CHA信号放大特性,使得探针的信噪比增加至对照探针的5倍,检测限为1 particle/μL。此外,该探针具备高特异性和高灵敏性,可实现混合样品检测,在5%超速离心的血清中能实现靶标的定量检测（检测限为127 particle/μL）,在10%超速离心的血清样中具有较好检测回收率（93%～100%）,而且还可用于细胞和临床血浆微量（μL）上清液的直接检测。在此基础上,DNA步行器还能进一步用于肝癌病人诊断,准确度为100%,由此证实N-糖蛋白在肝癌临床诊断中存在巨大潜力,因此该方法有望为肿瘤早期诊断提供技术方法与重要信息。