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随着微生物学研究的不断深入，研究者们迫切需要一种可以直接在活组织或动物消化道的任何时候随时被检测到的细胞标记物(cell marker)，从而可跟踪活的受体菌株中的分子事件。绿色荧光蛋白基因相对于其它报告蛋白基因在原位、实时的微生物生理生化研究中有很多优越性，受到越来越广泛的关注。本研究应用绿色荧光蛋白基因作为报告基因，构建了非抗生素抗性的示踪表达载体pW425t-GFP，并将其转化大肠杆菌X13。成功获得表达绿色荧光蛋白基因的大肠杆菌pW425t-GFP，在无抗生素压力选择情况下，连续培养10代，绿色荧光蛋白在重组菌中能获得稳定表达。最后将上述重组菌pW425t-GFP口服接种BALB／c小鼠，观察其在消化道中的分布。具体研究内容如下：首先根据质粒PGFP uv的绿色荧光蛋白基因序列设计了一对引物，以载体质粒为模板，应用聚合酶链式反应(PCR)技术，扩增了938bp的含有LacZ启动子的GFP全基因。通过T-A克隆技术，将PCR产物克隆至pGEM-T-Vector中，转化至受体菌JM109中，通过质粒提取、限制性内切酶酶切、PCR、序列测定等方法鉴定构建出重组阳性克隆质粒pGEM-T-GFP。经DNASTAR软件分析核苷酸序列，结果显示该基因与Genbank上纪录的GFP基因序列同源性达到100％。然后应用基因体外重组技术，将ThyA／红霉素双抗性表达载体pW425et中的红霉素抗性基因替换为含有强启动子的GFP基因，构建了非抗生素抗性的示踪表达载体pW425t-GFP，通过质粒提取、限制性内切酶酶切、PCR等方法鉴定构建出的重组阳性表达载体pW425t-GFP，并通过SDS-PAGE电泳检测绿色荧光蛋白基因的表达量。经荧光显微镜观察，结果显示该表达载体能稳定的表达出绿色荧光蛋白，并能发出稳定的绿色荧光。在无抗生素压力选择情况下，连续培养10代，绿色荧光蛋白在重组菌中能获得稳定表达。将上述获得稳定表达绿色荧光蛋白的重组菌给小鼠口服，观察该重组菌在胃肠道中的分布。重组菌口服接种4周龄BALB／c小鼠，于接种后2，6，12，24，48和72h．……分别取胃肠内容物接种培养并计数，同时取胃、空肠、回肠和盲肠做冷冻切片，在荧光显微镜下观察重组菌的分布。结果表明重组菌pW425t-GFP在接种小鼠6h后，胃肠道的内容物中可发现pW425t-GFP。在42h时细菌数量达到最大，并且3d后胃肠道中仍存在一定数量(约10~4CFU／g)的重组菌。表明该重组菌可较长时间的定植于肠黏膜表面。在荧光显微镜下可清晰的观察到pW425t-GFP主要存在于肠道的内容物中，少数细菌粘附在各肠段的黏膜上。本研究为该示踪载体的进一步应用提供了理论基础和实验模型。