日本乙型脑炎病毒（Japanese encephalitis virus,JEV）为黄病毒科黄病毒属成员,单股正链RNA病毒,基因组全长11kb,共编码3种结构蛋白（C、E、Pr M）与7种非结构蛋白（NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B、NS5）,根据E基因乙型脑炎病毒分为5种基因型（GI-GV）。乙型脑炎病毒主要由蚊子、猪和飞禽类传播,其中库蚊是乙型脑炎病毒的主要传播媒介,猪感染后易形成高滴度和持久的病毒血症,是病毒的主要放大宿主。流行性乙型脑炎在亚洲东南部地区较为流行,也是我国流行性脑炎之一。对于流行地区的人群接种疫苗、控制媒介密度与加强生猪的管控可有效的遏制乙型脑炎病毒的传播。以本实验室分离保存的乙型脑炎病毒毒株（JEV-mosq-YN-2016）,通过PCR方法扩增目的片段1751bp,测序后使用Meg Align软件比对分析,结果显示JEVmosq-YN-2016毒株为基因I型乙型脑炎病毒,与中国云南JEV毒株（Gen Bank:KT229573.1）同源性最高为98.30%。通过非标定量蛋白质组学技术探究乙型脑炎病毒对猪生殖器官的潜在作用机制。以基因I型JEV-mosq-YN-2016毒株侵染猪睾丸细胞,2MOI进行接毒试验,收取4个时间点（0h、6h、12h、24h）的蛋白样品,使用液相色谱-质谱联用（LC-MS）技术对样品统计分析,根据Uni Prot蛋白质数据库搜索样本特异性蛋白,然后对数据库搜索结果进行肽段和蛋白水平的质控分析,并对鉴定到的蛋白进行常见功能数据库注释及蛋白的定量分析。根据定量的结果进行差异筛选,当P value≤0.05时,以差异表达量变化超过1.5作为显著上调的变化阈值,小于1/1.5作为显著下调的变化阈值,统计24h-0h组差异蛋白共计595个,并通过GO二级分类、COG/KOG分类、KEGG通路及亚细胞结构注释进行分析,基于不同分类方法得到的统计结果,采用Fisher确切检验方法进行富集分析,得到相关差异主要集中在免疫反应、信号转导、生物合成与代谢等方面,由富集聚类分析比较不同时间点差异蛋白在功能上的联系,然后通过火山图筛选出特定差异蛋白BCL10、NF-κBp65、ICAMI等。以Western blot方法对差异蛋白验证,结果如下:（1）蛋白质组学筛选目的蛋白BCL10:在乙型脑炎病毒侵染猪睾丸细胞6h、12h组蛋白BCL10表达量显著上调,接毒24h组蛋白表达量显著下调,接毒24h-0h组蛋白表达量显著上调,与蛋白质组学预期结果相同。（2）NF-κB信号通路:根据蛋白BCL10表达的显著差异查到下游信号通路,定位到NF-κB信号通路,根据Western blot验证NF-κB信号通路中NF-κBp65、IKBα、IKKα蛋白,结果显示在接毒6h组,IKKα和NF-κBp65、IKBα蛋白表达显著上调。（3）Toll样受体信号通路:探究NF-κB上游信号通路得到Toll样受体信号通路的My D88依赖型与My D88非依赖型途径蛋白有显著变化,My D88依赖型途径中,接毒6h组,TLR4、My D88、IRAK-4、IRAK-1、TRAF6、TAB1、TAK1蛋白表达显著上调。My D88非依赖型途径中,接毒6h组,TLR3、TRAF3、TBK1蛋白显著上调。以q PCR方法对细胞因子进行基因水平验证,结果如下:（1）Toll样受体信号通路My D88依赖型途径中,检测细胞因子白细胞介素β（IL-1β）、白细胞介素12（IL-12）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）,在接毒6h、12h组,细胞因子IL-1β、IL-12、TNF-α表达显著上调。（2）Toll样受体信号通路My D88依赖型途径中,检测细胞因子干扰素α（IFN-α）、干扰素β（IFN-β）,在接毒6h、12h、24h组,细胞因子IFN-α、IFN-β均显著上调。本研究通过验证Toll样受体信号通路的TLR4、My D88、IRAK4、TRAF6等蛋白及细胞因子,确定了Toll样受体信号通路TLR4介导的My D88依赖型途径被激活,进而促进NF-κB信号通路参与免疫应答、炎症反应,Toll样受体信号通路TLR3介导的My D88非依赖型途径被激活并产生I型干扰素参与免疫调节作用。