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目的:多环芳烃(Polycyclic aromatic hydrocarbons,PAHs)作为细颗粒物(Fine particulate matter,PM2.5)的主要有机组成成分,可引起多种呼吸系统疾病。本课题组前期体内外研究发现,低分子量-PAHs(Low molecular weight-PAHs,LMW-PAHs)可引起大鼠肺组织和人肺腺癌基底上皮细胞(A549)发生氧化应激和炎症反应,该过程可能与PI3K/AKT等信号通路的激活有关,且联合作用高于单独作用。因此,本研究在前期研究基础上,通过构建菲(Phe)和芴(Flu)两种LMW-PAHs联合暴露致炎症反应过程中内源性竞争性RNA(Competitive endogenous RNA,ceRNA)网络,找寻确定的circRNA-miRNA-mRNA调控环路,探索LMW-PAHs诱导炎症反应的转录调控规律,以期深入研究LMW-PAHs暴露致炎症的分子机制。方法:(1)以600μM的Phe和Flu混合物染毒A549细胞24小时,提取总RNA,全转录组测序检测差异表达的circRNAs、miRNAs和mRNAs,并进行GSEA富集分析;基于基因本体学(GO)和京都基因与基因组百科全书(KEGG)数据库富集分析结果筛选出与炎症相关的基因;(2)使用Target Scan(v5.0)、miRanda(v3.3a)软件对显著性差异的nc RNAs分别进行靶基因预测(miRNA的靶基因为mRNA,circRNA的靶基因为miRNA);取预测的交集,基于共同的miRNA结合构建ceRNA网络,结合Cytoscape软件构建网络图,实现调控关系的可视化;(3)使用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)验证部分RNAs的表达水平,结合文献选取目标circRNA-miRNA-mRNA调控轴,并检测参与基因(hsa_circ_0039929/hsa_miR-15b-3p_R-1/FGF2)在200、400和600μM的LMWPAHs(Phe+Flu)染毒水平的表达剂量效应关系;(4)使用Western blot检测不同浓度LMW-PAHs处理对PI3K/AKT信号通路和EMT标志物相关蛋白的表达水平;(5)使用mimics过表达hsa_miR-15b-3p_R-1,分别进行单独过表达实验(分为Mock组、NC.组、Mimics组)和过表达后LMW-PAHs染毒实验(分为Mock+Control组、NC.+Control组、Mimics+Control组、Mock+LMW-PAHs组、NC.+LMW-PAHs组、Mimics+LMW-PAHs组),RT-qPCR检测ceRNA相关基因水平,Western blot检测FGF2、PI3K/AKT信号通路和EMT相关蛋白水平;(6)使用siRNA-1和siRNA-2两个干扰位点敲低hsa_circ_0039929,分别进行单独低表达实验(分为Mock组、NC.组、siRNA-1组、siRNA-2组)和低表达后LMW-PAHs染毒实验(分为NC.+Control组、siRNA-1+Control组、siRNA-2+Control组、NC.+LMW-PAHs组、siRNA-1+LMW-PAHs组、siRNA-2+LMWPAHs组),RT-qPCR检测ceRNA相关基因水平,Western blot检测FGF2、PI3K/AKT信号通路和EMT相关蛋白水平。结果:(1)测序和生物信息学分析:转录组测序结果显示,经LMW-PAHs(600μM Phe+Flu)处理的A549细胞中,有195个circRNA、106个miRNA和1838个mRNA在实验组和对照组中显著差异表达(P<0.05)。差异基因GSEA富集分析显示,炎症反应、PI3K/AKT信号通路和EMT是主要富集的生物学过程;(2)基因筛选和验证:根据基因功能富集分析和ceRNA机制筛选出14个mRNA、62个miRNA和181个circRNA构建与炎症相关的circRNA-miRNAmRNA网络。RT-qPCR验证网络中14个mRNA、13个miRNA和10个circRNA基因表达水平,分别有8个mRNA、7个miRNA和5个circRNA表达趋势与测序结果一致,组成11条ceRNA。基于基因功能和文献,选取hsa_circ_0039929/hsamiR-15b-3p_R-1/FGF2作为本研究目标ceRNA。经验证,与对照组相比,200μM和600μM LMW-PAHs组hsa_circ_0039929的表达水平显著升高;而hsa-miR-15b-3p_R-1的表达水平随着LMW-PAHs浓度的升高呈剂量依赖性下降趋势(P<0.05)。FGF2基因和蛋白表达水平在400μM和600μM组中,与对照组相比均显著上调(P<0.05)。(3)LMW-PAHs对PI3K/AKT通路和EMT的影响:经200、400和600μM的LMW-PAHs染毒处理24小时后,与对照组相比,PI3K、AKT总蛋白表达水平各浓度组间均无显著变化(P>0.05),而磷酸化水平在400和600μM组均显著上调(P<0.05)。与200μM组相比,AKT总蛋白水平在600μM组有显著升高,p-PI3K水平在400和600μM组都显著升高(P<0.05)。另外,与对照组相比,各LMW-PAHs处理组上皮标志物E-cadherin的表达水平显著下降,间充质标志物Vimentin和α-SMA蛋白表达水平显著上升(P<0.05)。(4)hsa-miR-15b-3p_R-1过表达对相关基因及PI3K/AKT通路和EMT的影响:1)单独过表达:与空白对照组(Mock)相比,过表达hsa-miR-15b-3p_R-1可显著下调hsa_circ_0039929和FGF2表达水平(P<0.05);引起p-PI3K、pAKT和细胞间充质标志物Vimentin和α-SMA的蛋白表达水平升高,上皮标志物E-cadherin的蛋白表达水平降低(P<0.05);2)过表达后LMW-PAHs染毒:(1)与空白对照组(Mock+Control)相比,Mimics+Control组hsa-miR-15b-3p_R-1基因表达水平显著上调,hsa_circ_0039929基因表达水平显著下调,FGF2的基因和蛋白水平均显著下调(P<0.05)。与暴露对照组(Mock+LMW-PAHs)相比,Mimics+LMW-PAHs组hsa-miR-15b-3p_R-1基因表达水平显著升高(P<0.01),hsa_circ_0039929呈下调趋势,但差异无统计学意义(P>0.05),FGF2的基因和蛋白表达水平均显著下降(P<0.05);(2)PI3K/AKT信号通路和EMT标志蛋白,与Mock+Control组相比,Mimics+Control组PI3K和AKT的总蛋白水平在各组间均没有显著变化(P>0.05),其磷酸化水平以及细胞间质标志物Vimentin和α-SMA的表达水平显著下降,上皮标志物E-cadherin表达水平显著上升(P<0.05);与Mock+LMW-PAHs组相比,Mimics+LMW-PAHs组中,p-PI3K和p-AKT的水平、Vimentin和α-SMA表达水平仍然显著下调(P<0.05),而E-cadherin的表达水平没有明显变化(P>0.05)。(5)hsa_circ_0039929低表达对相关基因及PI3K/AKT通路和EMT的影响:1)单独低表达:与Mock组相比,低表达hsa_circ_0039929可以显著上调hsa-miR-15b-3p_R-1基因表达水平,显著下调FGF2的基因和蛋白水平(P<0.05)。Western blot分析显示,与Mock组相比,siRNA-1和siRNA-2组中PI3K和AKT总蛋白水平没有显著变化,磷酸化水平显著降低(P<0.05);EMT标志物中Vimentin和α-SMA表达水平显著升高,E-cadherin表达水平显著降低(P<0.05);2)低表达后LMW-PAHs染毒:根据前述结果,Mock和NC.组基因和蛋白表达水平均无显著差异,故以NC.+Control和NC.+LMW-PAHs作为对照组。(1)与NC.+Control组相比,siRNA-1+LMW-PAHs组和siRNA-2+LMW-PAHs组中hsa_circ_0039929基因显著下调,hsa-miR-15b-3p_R-1基因显著上调,FGF2的基因和蛋白水平均显著下调(P<0.05);与NC.+LMW-PAHs组相比,hsa_circ_0039929基因在siRNA-2+LMW-PAHs组显著下调,hsa-miR-15b-3p_R-1基因在siRNA-1+LMW-PAHs组和siRNA-2+LMW-PAHs组均显著上调,FGF2蛋白表达水平在siRNA-1+LMW-PAHs组和siRNA-2+LMW-PAHs均显著下调而基因水平仅在siRNA-1+LMW-PAHs组显著下调(P<0.05);(2)PI3K/AKT信号通路和EMT标志蛋白,与NC.+Control组相比,各处理组中PI3K、AKT的总蛋白水平均没有明显变化,siRNA-2+Control组中p-PI3K、p-AKT的水平和显著下降,siRNA-1+Control组中Vimentin和α-SMA蛋白表达水平显著下降(P<0.05);与NC.+LMW-PAHs组相比,siRNA-1+LMW-PAHs组的p-PI3K、p-AKT的水平显著下降(P<0.05),siRNA-1+LMW-PAHs和siRNA-2+LMW-PAHs组中Ecadherin显著上升、Vimentin显著下降,α-SMA蛋白仅在siRNA-2+LMW-PAHs组显著下降(P<0.05)。结论:LMW-PAHs(Phe+Flu)可激活A549细胞中PI3K/AKT信号通路,诱发EMT,其分子机制可能为hsa_circ_0039929作为hsa-miR-15b-3p_R-1的“海绵”并抑制其有效性,从而上调FGF2的表达,激活PI3K/AKT信号通路,诱导EMT发生。