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睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonas testosteroni,CT)ATCC1 996是以甾体激素作为唯一碳源的革兰氏阴性细菌,并以甾体激素作为能源物质,进行代谢活动,关于其对激素的降解作用及影响其激素降解的调控因子研究在近几年被众多学者广泛关注。在之前的研究中已报道了CT的基因组序列,并描述和表征了几种甾体代谢酶与甾体结合的反应过程。CT菌分解甾体激素的过程错综复杂,一共有几十种酶先后共同参与了它的代谢过程,SDR短链脱氢酶就是众多代谢酶家族中的一员。通过转录组数据分析得到SDRy基因对激素降解具有一定正向作用,对该基因进行如下的一系列研究。本文通过敲除株的构建、质粒共转化、酶联免疫吸附(ELISA)等技术手段对睾丸酮丛毛单胞菌中SDRy在甾体激素降解过程中的生物学作用,以及睾丸酮丛毛单胞菌中四种蛋白(Lys R、Tet R、Lux R1、Lux R2)对SDRy的生物学调控作用进行了一系列研究。首先通过构建SDRy的基因敲除菌株(M-CT),并对其进行五种不同激素诱导,利用高效液相色谱法检测激素剩余量,进一步证明SDRy对激素降解有一定影响;之后构建SDRy蛋白表达载体并进行原核表达,得到纯化的目的蛋白并制备小鼠多克隆抗体;最后构建四种不同调控蛋白与SDRy包括前端疑似启动子部分(QSDRy)的共转化菌株,利用Western Blot定性,ELISA方法检测其调控作用。实验结果表明:通过基因敲除实验得到,在五种激素诱导条件下,CT菌野生型与敲除株的激素降解量相差最大为睾丸酮61%,孕酮和雌二醇相差量分别为13%、9%,雌酮与甲睾酮条件下二者降解量相差不大,可推断SDRy在CT菌降解睾丸酮过程中起重要作用;成功得到浓度为9.75 mg/m L的SDRy蛋白,利用免疫学方法制备小鼠多克隆抗体效价达到1:25600,并绘制多抗标准曲线R2>0.995,线性关系良好;成功构建了p K-QSDRy、p UC-Lys R/Tet R/Lux R1/Lux R2重组质粒,并分别共转化至HB101中进行表达,ELISA方法对比SDRy蛋白表达量变化,得出结论Tet R调控蛋白在两种甾体激素诱导下均表现出明显的正向促进作用,且在睾丸酮诱导下效果明显高于孕酮诱导,Lux R1、Lux R2调控蛋白在两种激素诱导下也表现出正向促进作用,但SDRy表达量只有微量提高,效果不明显,Lys R调控蛋白在两种激素诱导下均无明显变化,推测对SDRy无直接调控作用。实验结果说明SDRy对甾体激素降解具有一定影响,其中Tet R调控蛋白对SDRy的表达具有正向促进作用,这为研究睾丸酮丛毛单胞菌的降解机制提供了理论及实验基础,为日后在自然界中类固醇激素的生物降解及基因调控研究提供实验依据。