背景背根神经节(dorsal root ganglion, DRG)的持续受压(chronic compression of DRG, CCD)和椎管狭窄或椎间盘突出压迫神经根是临床上根性神经疼痛的主要原因之一。CCD大鼠模型是一种典型的神经疼痛模型,它可以产生自发性疼痛、机械性的热痛觉过敏和异常疼痛,伴随着受压迫神经元的自发性放电增加,电流阈值和动作电位降低。外周神经损伤能够通过背根神经节和脊髓中一系列复杂的分子级联反应诱发神经病理性疼痛,包括肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor, TNF-a)、白介素-6(interleukin-6, IL-6)和核因子κB(nuclear faetor-kappa B, NF-κ B).细胞内的第二信使环磷腺苷(cyclic adenosine monophosphate, cAMP)-依赖性的蛋白激酶A(protein kinase A, PKA)和环磷鸟苷(cyclic guanosine monophosphate, cGMP)-依赖性的蛋白激酶G (protein kinase G, PKG)介导CCD大鼠的痛觉过敏和受压神经元的高兴奋性。另外,多种离子通道被认为参与并传递持续受压后DRG神经元的伤害性刺激,如电压门控性Na+通道和K+通道、超极化激活性阳离子通道和瞬时感受器电位离子通道香草素受体亚家族4通道(transient receptor potential vanilloid, TRPV4)等。TRPV4是一种多觉型感受器,可被低渗、机械刺激、热、佛波醇酯、低pH值、柠檬酸盐、anandamide (AEA)和其代谢产物花生四烯酸(arachidonic acid, AA)、以及bisandrographolide A (BAA)等激活。前列腺素E2(PGE2)可增强低渗(17mOsm)或中度高渗溶液刺激(2%NaCl,607mOsm)引起的机械性痛觉过敏和异常疼痛,TRPV4通道参与介导上述炎症性痛觉反应。TRPV4基因敲除的小鼠表现出体液渗透压调节功能异常,对伤害性压力刺激的回避反应降低,但对非伤害性热和触觉刺激的反应正常。TRPV4基因敲除小鼠也表现出对炎症引起的热痛觉过敏降低。一氧化氮(nitric oxide, NO)是动物疼痛模型中一种重要的参与伤害活动的调质,并且介导了神经病理疼痛的发生。有文献报道,TRPV4的激动剂4a-PDD (4a-phorbol12,13-didecanoate)和低渗溶液的刺激在毛豚鼠耳蜗的细胞外层能够诱导一氧化氮的合成,而通过TRPV4的阻断剂钌红(ruthenium red, RR)能够抑制一氧化氮的生成。我们前期的研究发现,TRPV4-NO-cGMP-PKG信号通路在CCD大鼠热痛觉过敏中发挥重要的作用。然而,到目前为止,在CCD大鼠热痛觉过敏中TRPV4与NO之间的具体的机制尚不清楚。NF-κB是基因转录的调控因子,由Rel家族的多亚基蛋白组成,包括：p50,p52, p65(RelA), c-Rel and RelB。NF-κB在细胞的生长、分化、坏死和凋亡过程中起重要作用,广泛参与肿瘤、炎症等病理过程。在正常状态下或者在静息状态的细胞中,NF-κB与其抑制性蛋白I-κ B结合,以二聚体的形式存在于细胞浆中,最常见的是二聚体是p65/p50。当细胞受到刺激时,I-κB蛋白被迅速磷酸化并与NF-κB解离,游离的NF-κB转移到细胞核内,参与众多基因的诱导表达。当受到细胞因子、氧化应急、一些化学和疼痛性伤害时,NF-κ B被激活。最近,有研究者发现,在脊髓和背根神经节(DRG)中NF-κB参与伤害性感觉信息的传递。低频和高频的电针灸刺激能够降低NF-κB敲出小鼠的痛觉敏感性。Bunnell等发现NF-κB的激活发生在背根神经节和脊髓,参与伤害性信息的传递和处理,部分坐骨神经损伤后大鼠腰背根神经节NF-κB的活性增加。Chan等对大鼠的后爪皮下注射弗罗因德佐剂做痛觉过敏模型,观察大鼠腰脊髓NF-κB表达的时程差异性,证实NF-κB在弗罗因德佐剂产生的痛敏实验的炎症前状态发挥重要作用。这些证据NF-κB参与介导了神经病理疼痛的传递。因此,我们推测在CCD大鼠热痛觉过敏中NF-κB可能参与了TRPV4-NO的信号通路。目的研究NF-κB介导的TRPV4-NO信号通路在CCD大鼠热痛觉过敏中的作用。方法1.建立CCD模型将大鼠随机分为CCD组和假手术组。大鼠先用戊巴比妥钠(50mg/kg,腹腔注射)麻醉后,沿L4-S1棘突作后正中偏右切口,暴露右侧L4及L5椎间外孔,将“L”形棒的一端沿L4及L5椎间外孔的前壁上方水平插入椎管内,另一端位于椎管壁外。通过控制“L”形棒椎管壁外侧端使其椎管内端沿椎骨内壁缓慢下滑至椎管中部,使之挤压L4、L5的大鼠背根神经节。术后用生理盐水冲洗切口,依层缝合肌肉、腰背筋膜和皮肤,腹腔注射青霉素预防感染。假手术组除不插钢棒压迫神经节外,其余操作同手术组。术后大鼠没有发生白残现象,也没有表现出感觉完全缺失。2. NF-κB的阻断剂对热痛敏感性的影响为了测量NF-κ B的阻断剂对热痛敏感性的影响,大鼠被随机分为假手术组(sham组)、NF-κ B的阻断剂(PDTC或BAY)处理组、生理盐水处理组。其中通过NF-κB的阻断剂PDTC处理组又分成PDTC (10-1M)组、PDTC (10-2M)组、PDTC (10-3M)三个亚组；NF-κB的阻断剂的另外一种阻断剂BAY处理组又分成BAY (100μM)组、BAY (50μM)组、BAY (25μM)三个亚组。假手术组中未接受任何处理的大鼠作为对照,CCD组中只接受CCD手术的大鼠作为对照。NF-κ B的阻断剂(PDTC或BAY)溶于0.9%的生理盐水通过鞘内注射,40μg/d,每天一次,共7天。3神经行为学测定于手术前连续测两天,每天一次。术后7天药物处理前2小时再次测量,排除痛觉表现不明显者(<5%),药物处理后1、2、4、8、24小时分别测量。对于鞘内注射NF-κB的阻断剂(PDTC或BAY)的大鼠,痛觉测量则在最后一次注射后12小时进行。热辐射刺激缩爪反应潜伏期(thermal withdrawl latency)使用BME-410A型热痛刺激仪,将热痛刺激仪放在6mm厚的有机玻璃板下方,使光源焦距照射动物后肢足底掌心,电子秒表记录从照射开始到引起后肢回缩反应时的潜伏期作为热痛觉观测指标。取每只大鼠5次测量结果的均值为统计数据。结果1NF-κB的阻断剂PDTC对大鼠热痛觉过敏的影响与假手术组相比,CCD大鼠产生明显的热痛觉过敏(n=8, F=245.054, P<0.001)。鞘内注射不同浓度的NF-κB的阻断齐IJPDTC (10-1M、10-2M、10-3M)各40μl,分别测注射后0、1、2、4、8和24h时的热刺激缩爪时间,结果显示：与生理盐水组相比,浓度10-1M、10-2M的PDTC对CCD后大鼠的热痛觉过敏产生抑制作用(n=8,P<0.001),此抑制作用注射后1h可测得,4h作用达到最大,大约能够持续到8h,直到24h作用消失。而浓度10-3M的PDTC对CCD后大鼠的热痛觉过敏没有明显的抑制作用(n=8,P>0.05)。2NF-κ B的阻断剂BAY对大鼠热痛觉过敏的影响与假手术组相比,CCD大鼠产生明显的热痛觉过敏(n=8,F=253.816,P<0.001)。鞘内注射不同浓度的NF-κB的阻断剂BAY (100uM、50uM、25uM)各40μl,分别测注射后0、1、2、4、8和24h时的热刺激缩爪时间,结果显示：与生理盐水组相比,浓度100uM、50uM的PDTC对CCD后大鼠热痛觉过敏产生抑制作用(n=8,P<0.001),此抑制作用注射后1h可测得,4h作用达到最大,大约能够持续到8h,直到24h作用消失。而浓度25uM的PDTC对CCD后大鼠的热痛觉过敏没有明显的抑制作用(n=8,P>0.05)。3TRPV4激动齐(?)4a-PDD对NF-κB的阻断剂PDTC的作用鞘内注射NF-κB的阻断齐(?)JPDTC (10-1M),分别测注射后0、1、2、4、8和24h时的热刺激缩爪时间。与生理盐水组相比,PDTC (10-1M)对CCD后大鼠热痛觉过敏产生抑制作用(n=8,P<0.001)。鞘内注射TRPV4激动剂4α-PDD (1nmol)预处理后,能够明显逆转PDTC (10-1M)对CCD后大鼠热痛觉过敏产生抑制作用(n=8,P<0.001)。4TRPV4激动剂4a-PDD对NF-κB的阻断剂BAY的作用鞘内注射NF-κ B的阻断剂BAY (100uM),分别测注射后0、1、2、4、8和24h时的热刺激缩爪时间。与生理盐水组相比,BAY (100uM)对CCD后大鼠热痛觉过敏产生抑制作用(n=8,P<0.001)。鞘内注射TRPV4激动剂4α-PDD (1nmol)预处理后,能够明显逆转BAY (100uM)对CCD后大鼠热痛觉过敏产生抑制作用(n=8,P<0.001)。结论在CCD大鼠的热痛觉过敏中,NF-κB参与介导了TRPV4-NO信号通路。背景一氧化氮(NO, nitric oxide)是一种在中枢和外周神经内传递细胞间及细胞内信号的信号分子,能够感受病理状态下的伤害性刺激,在神经病理性疼痛及痛觉过敏的发生和持续过程中发挥重大作用。NOS有三种类型：神经元型NOS(neuronal NOS, nNOS),内皮型NOS(endothelial NOS, eNOS),诱导型NOS (inducible NOS, iNOS)。通常在有氧的环境下,NOS介导L-精氨酸生成NO。在病理状态或缺氧情况下,神经组织的NOS表达升高,NO是由NOS在一定的条件下合成,因此神经系统NO的病理作用可能受控于NOS表达的变化和活性的变化。在神经组织,nNOS主要表达于神经元内,促进NO的合成。多种神经病理疼痛模型实验已经证实nNOS诱导产生的NO参与介导伤害性疼痛发展过程。近年来,iNOS也逐渐成为研究神经痛病理机制的一个重要介质。有学者指出,iNOS在脊髓损伤后的痛觉高敏过程发挥特殊作用,因此认为,iNOS在神经组织的高表达可能参与介导痛觉过敏过程。另外,神经组织内nNOS和iNOS在坐骨神经持续缩窄性损伤和脊神经结扎模型中表达升高,也证实了两者在神经痛中的作用。虽然已经有大量的证据表明nNOS和iNOS在上述两种神经痛模型的痛觉过敏中发挥作用,但是两者是否参与其它神经痛动物模型的痛觉高敏过程还不甚清楚。NF-κB是基因转录的调控因子,由Rel家族的多亚基蛋白组成,包括：p50,p52, p65, c-Rel and RelB。NF-κB在细胞的生长、分化、坏死和凋亡过程中起重要作用,广泛参与肿瘤、炎症等病理过程。在正常状态下或者在静息状态的细胞中,NF-κB与其抑制性蛋白I-κB结合,以二聚体的形式存在于细胞浆中,最常见的是二聚体是p65/p50。当细胞受到刺激时,I-κB蛋白被迅速磷酸化并与NF-κB解离,游离的NF-κ B转移到细胞核内,参与众多基因的诱导表达。当受到细胞因子、氧化应急、一些化学和疼痛性伤害时,NF-κB被激活。体内NF-κB的活化过程调控包括两条途径。一是经细胞外的正反馈途径：这是炎症反应放大的重要机制,前炎症介质TNF-α、IL-1及活性氧介质(ROI)是NF-κB的强诱导剂。前炎症介质对NF-κB的活化就属于正反馈调节,在其诱导下,NF-κB活化后,可增强TNF-α和IL-1β的基因转录,使其产生和释放增多,进而再次激活NF-κB;还可使IL-6和IL-8产生和释放增多,导致最初的炎症信号进一步放大。二是经细胞内、外的负反馈途径：在细胞内,NF-κB活化后,在启动炎症介质基因转录的同时,抑制蛋白如Iκ B-α和p105的基因转录亦被上调,IκB基因上的启动子区域含有κB序列,κB序列被降解后,激活的NF-κB可使其生成增加,从而又可与NF-κB结合,甚至可进入核内与活化的NF-κB结合,竞争性抑制NF-κB与DNA上的结合位点结合,从而下调细胞核中NF-κ B的活性,终止炎症介质的生成；在细胞外,刺激NF-κB由活化的因素,如LPS、TNF-α和IL-1等也可导致抗炎因子如IL-10、IL-13等的产生,后者可抑制NF-κB的激活,反馈抑制促炎因子的转录和表达。但IκB-β则不能被NF-κB诱导再生,故在Iκ B-β占优势的细胞内NF-κB的活化有持续存在的可能。NF-κB活性有两种类型,即NF-κ B组成活性和NF-κB诱导活性,NF-κB组成活性是指细胞处于静息状态时,其细胞内即有一定水平的NF-κB活性,往往与机体某些重要的发挥生理作用的大分子表达有关,在体内表现出持续性存在的特点。NF-κB诱导性活性指某些因素刺激使细胞内NF-κB活性水平迅速增加,多与机体应急有关,刺激因素解除后,诱导活性在一定的时间内大都可以平息下来,否则将扰乱体内神经内分泌一细胞因子网络,带来严重的病理性危害。最近,有研究者发现,在脊髓和背根神经节(DRG)中NF-κB参与伤害性感觉信息的传递。低频和高频的电针灸刺激能够降低NF-κB敲出小鼠的痛觉敏感性。Bunnell等发现NF-κB的激活发生在背根神经节和脊髓,参与伤害性信息的传递和处理,部分坐骨神经损伤后大鼠腰背根神经节NF-κB的活性增加。Chan等对大鼠的后爪皮下注射弗罗因德佐剂做痛觉过敏模型,观察大鼠腰脊髓NF-κB表达的时程差异性,证实NF-κB在弗罗因德佐剂产生的痛敏实验的炎症前状态发挥重要作用。这些证据NF-κB参与介导了神经病理疼痛的传递。因此,我们推测在CCD大鼠背根神经节持续机械刺激后NF-κB可能参与了其中的分子机制及这些类型的NOS是否与TRPV4有相关性。目的1.观察CCD对DRG中NO的含量。2.观察NF-κB在CCD大鼠背根神经节持续机械刺激后的表达及在组织化学中的定位。3.明确NF-κB参与介导TRPV4-NO信号通路中nNOS的作用。方法1.建立CCD模型将大鼠随机分为CCD组和假手术组。大鼠先用戊巴比妥钠(50mg/kg,腹腔注射)麻醉后,沿L4-S1棘突作后正中偏右切口,暴露右侧L4及L5椎间外孔,将“L”形棒的一端沿L4及L5椎间外孔的前壁上方水平插入椎管内,另一端位于椎管壁外。通过控制“L”形棒椎管壁外侧端使其椎管内端沿椎骨内壁缓慢下滑至椎管中部,使之挤压L4、L5的大鼠背根神经节。术后用生理盐水冲洗切口,依层缝合肌肉、腰背筋膜和皮肤,腹腔注射青霉素预防感染。假手术组除不插钢棒压迫神经节外,其余操作同手术组。术后大鼠没有发生自残现象,也没有表现出感觉完全缺失。2.亚硝酸盐产物(NO)测量亚硝酸盐水平间接反应DRG内NO产物的含量,按照亚硝酸盐检测试剂盒进行操作。3.细胞核蛋白/浆蛋白的提取从各组大鼠DRG中提取蛋白质,按照组织细胞核蛋白/浆蛋白抽提试剂盒进行操作。4. Western blotting检测从各组大鼠DRG中提取蛋白质,Western blotting检测胞核中NF-κB、胞浆中I-K B蛋白表达量的变化以及大鼠DRG中nNOS的表达变化。5.实时定量PCR检测从各组大鼠DRG中提取RNA,实时定量PCR检测胞核中NF-κB、胞浆中I-κB mRNA的改变以及大鼠DRG中nNOS mRNA的改变。6.免疫组织化学大鼠麻醉后经颈动脉灌注4%多聚甲醛固定,然后迅速取出DRG,4%多聚甲醛固定7-8小时,经过脱水浸蜡过程将组织石蜡包埋,切成厚约5微米的石蜡切片,行nNOS、NF-κB的免疫组化染色。结果1.NF-κB的阻断齐(?)PDTC和BAY对大鼠DRG中NO衍生产物亚硝酸盐浓度的影响鞘内注射NF-κB的阻断剂PDTC(10-1M)40μl,分别测注射后0、1、2、4、8和24h时DRG中的亚硝酸盐浓度,结果显示：与鞘内注射生理盐水组相比,10-1M的PDTC组明显降低DRG亚硝酸盐浓度,1h后有所降低(n=8,P<0.05),4h作用最大(n=8,P<0.05),大约能够持续到8h,但是,24h后没有明显的作用(n=8,P>0.05)。其浓度的变化与热痛觉过敏反应呈负相关(r=-0.966,P<0.05)。鞘内注射NF-κB的阻断齐(?)BAY(100uM)40μl,分别测注射后0、1、2、4、8和24h时DRG中的亚硝酸盐浓度,结果显示：与鞘内注射生理盐水组相比,100uM的BAY组明显降低DRG亚硝酸盐浓度,1h后有所降低(n=8,P<0.05),4h作用最大(n=8,P<0.05),大约能够持续到8h,但是,24h后没有明显的作用(n=8,P>0.05)。其浓度的变化与热痛觉过敏反应呈负相关(r==-0.952,P<0.05)。2. TRPV4激动齐(?)4α-PDD对大鼠DRG中NO衍生产物亚硝酸盐浓度的影响鞘内注射NF-κB的阻断齐(?)PDTC(10-1M)后,大鼠DRG中NO衍生产物亚硝酸盐浓度明显降低(P<0.05)。鞘内注射TRPV4激动剂4α-PDD(1nmol)预处理后,能够明显逆转PDTC(10-1M)对CCD后大鼠DRG中NO衍生产物亚硝酸盐的浓度(n=8,P<0.05)。鞘内注射NF-κB的阻断剂BAY(100uM)后,大鼠DRG中NO衍生产物亚硝酸盐浓度明显降低(P<0.05)。鞘内注射TRPV4激动齐(?)4α-PDD(1nmol)预处理后,能够明显逆转BAY(100uM)对CCD后大鼠DRG中NO衍生产物亚硝酸盐的浓度(n=8,P<0.05)。3.Western blotting示胞浆中I-κ B、胞核中NF-κB以及不同处理后大鼠DRG中nNOS蛋白表达量的变化Western blotting结果显示；与大鼠CCD组相比,鞘内注射NF-κB的阻断剂PDTC后,Westem blotting显示胞浆中I-κB的表达量明显升高(P<0.05)。鞘内注射TRPV4激动齐(?)4a-PDD (1nmol)预处理后,能够明显逆转PDTC对CCD后大鼠DRG中NF-κB的表达量(n=4,P<0.05)。与大鼠CCD组相比,鞘内注射NF-κB的阻断齐(?)PDTC后,胞核中NF-κB的表达量明显降低(n=4,P<0.05)。鞘内注射TRPV4激动剂4a-PDD (1nmol)预处理后,能够明显逆转PDTC对CCD后大鼠DRG中NF-κB的表达量(n=4,P<0.05)。另外,与大鼠假手术组相比,CCD组大鼠DRG中nNOS的表达量明显升高(n=4,P<0.05)。鞘内注射NF-κB的阻断剂PDTC后预处理后,能够明显逆转CCD后大鼠DRG中nNOS的表达量(n=4,P<0.05)。4. RT-PCR示胞浆中I-κ B mRNA、胞核中NF-κ B mRNA以及大鼠DRG中nNOS mRNA表达量的变化RT-PCR结果显示：与大鼠CCD组相比,鞘内注射NF-κB的阻断剂PDTC后,RT-PCR显示胞浆中I-κ B mRNA的表达量明显升高(n=3,P<0.05)。鞘内注射TRPV4激动剂4a-PDD (1nmol)预处理后,能够明显逆转PDTC对CCD后大鼠DRG中I-κ B mRNA的表达量(n=3,P<0.05)。与大鼠CCD组相比,鞘内注射NF-κ B的阻断剂PDTC后,胞核中NF-κ B mRNA的表达量明显降低(P<0.05)。鞘内注射TRPV4激动剂4a-PDD (1nmol)预处理后,能够明显逆转PDTC对CCD后大鼠DRG中NF-κ B mRNA的表达量(n=3,P<0.05)。另外,与大鼠假手术组相比,CCD组大鼠DRG中nNOS mRNA的表达量明显升高(n=3,P<0.05)。鞘内注射NF-κ B的阻断剂PDTC后预处理后,RT-PCR显示能够明显逆转CCD后大鼠DRG中nNOS mRNA的表达量(n=3,P<0.05)。5.免疫组化检测不同处理后大鼠DRG中NF-κB, nNOS表达的改变免疫组化结果显示：与大鼠假手术组相比,CCD组大鼠DRG中NF-κB的阳性细胞数明显升高(n=3,P<0.05)。鞘内注射NF-κB的阻断剂IPDTC后预处理后,大鼠DRG中NF-κB的阳性细胞数明显减少(n=3,P<0.05)。另外,与大鼠假手术组相比,CCD组大鼠DRG中nNOS的阳性细胞数明显升高(P<0.05)。鞘内注射NF-κ B的阻断剂PDTC后预处理后,大鼠DRG中nNOS的阳性细胞数明显减少(n=3,P<0.05)。结论NF-κB可能诱导产生了nNOS,生成NO,并且参与介导大鼠背根神经节持续机械刺激后TRPV4-NO痛觉过敏的分子机制信号通路。