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食管癌是我国高发的消化道恶性肿瘤之一,其发病率和死亡率呈逐年上升趋势。食管癌发病部位不易被察觉且早期无明显症状,确诊时多为中晚期。常规治疗方案是早期食管癌患者以手术为主,中晚期采用多学科综合治疗如放化疗联用。虽然放化疗联用的治疗方法可有效改善患者生存率,但肿瘤细胞若发生放化疗抵抗往往会削弱治疗疗效,而放疗和化疗剂量加大又会使周围正常组织产生不必要的损伤。放化疗抵抗仍是临床治疗面临的重要挑战,因此阐明放化疗抵抗的机制,寻求新的治疗手段是提高放化疗敏感性,改善患者预后的关键。肿瘤干细胞具有自我更新且多向分化的潜能,被认为是肿瘤发生的原始细胞,且与肿瘤放化疗抵抗、复发、转移、预后不良有着密切关系。GLI1是Hedgehog（Hh）信号通路的主要效应因子,对干性的维持起着至关重要的作用。然而GLI1在食管癌发生发展及干性维持等方面的作用,仍需进一步探究。热疗是一种通过外源能量加热肿瘤达到治疗目的的绿色疗法,常作为“增敏剂”与化疗或放疗联合应用。但是否通过调控食管癌细胞干性达到增敏放化疗的效果,还尚不可知。本研究发现GLI1在食管癌样本中高表达,且与患者的肿瘤分期、淋巴结转移成正相关,并且GLI1可促进食管癌细胞系的恶性增殖能力及肿瘤干性的形成。我们使用43℃恒温水浴模拟临床热疗,对细胞进行热处理。热激可使细胞周期阻滞在G0/G1期,并诱导细胞发生凋亡,起到抑制细胞增殖的作用。同时可通过调控GLI1进而下调SOX2、NANOG、OCT4等干性相关基因的表达,抑制肿瘤细胞的干性。此外热激促进GLI1与HSP70相互作用并介导GLI1的泛素化修饰,最终经蛋白酶体途径降解。热激还可有效抑制裸鼠移植瘤的恶性增殖能力及干性形成能力。方法1.探讨GLI1对食管癌细胞增殖及干性能力的影响使用生物信息学方法挖掘GLI1在人食管癌组织中的表达情况及与患者不良预后的相关性;利用食管癌细胞系KYSE70和KYSE140瞬转GLI1过表达质粒及转染GLI1 si RNA,CCK-8、克隆形成实验和Western Blot检测GLI1对食管癌细胞KYSE70和KYSE140体外增殖能力的影响;成球实验、Western Blot及q RT-PCR检测GLI1对KYSE70和KYSE140细胞体外干性形成能力的影响。2.探讨热激是否通过调控GLI1影响食管癌细胞的增殖及干性形成能力CCK-8、Western Blot检测热激对食管癌细胞增殖能力的影响;流式细胞术检测热激对食管癌细胞细胞周期及凋亡的影响;成球实验、Western Blot、q RTPCR及免疫荧光实验检测热激对食管癌细胞干性形成能力的影响;Western Blot检测热激对GLI1产生的影响。3.探讨热激调控GLI1的分子机制使用蛋白酶体途径抑制剂、溶酶体途径抑制剂探究GLI1发生降解的途径;使用HSP70抑制剂和HSP90抑制剂,通过Western blot实验检测其对GLI1降解产生的影响;通过免疫共沉淀实验检测热激对GLI1泛素化修饰水平的影响;免疫共沉淀检测蛋白酶体途径抑制剂、溶酶体途径抑制剂、HSPs蛋白抑制剂能否逆转热激导致的GLI1降解及泛素化修饰水平的变化。4.探讨热激在体内对食管癌细胞增殖能力及干性的影响构建食管癌裸鼠皮下移植瘤模型,检测热激在体内对食管癌细胞增殖能力的影响;Western blot用于检测PCNA、CDK1、p27、SOX2、NANOG、OCT4等增殖相关基因及干性标记基因的变化。结果1.GLI1促进食管癌细胞的增殖及干性GLI1在食管癌患者的临床样本中表达显著上调,且与患者淋巴结转移情况、临床分期等关系密切;GLI1对食管癌细胞的增殖有显著促进作用;过表达GLI1可增加食管癌细胞的干性,且干细胞相关基因NANOG、SOX2、OCT4可能在GLI1诱导食管癌干性增加的过程中发挥关键作用。2.热激通过调控GLI1抑制食管癌细胞的增殖及干性形成能力热激可有效抑制食管癌细胞的增殖,且增殖相关标记物PCNA、CDK1表达下调,p27表达上调;热激可改变细胞周期的分布,使其发生G0/G1期细胞阻滞,并诱导细胞发生凋亡;热激后干细胞球的大小及形成的数目都显著减少,干细胞球中干细胞标志基因SOX2的累积量明显下降,热激可显著抑制食管癌细胞的干性;热激后GLI1蛋白水平立即发生下调,m RNA水平无明显变化,且干性标记基因在热激24h后发生下调。热疗可直接降解GLI1进而影响食管癌细胞干性。3.热激可增加GLI1的泛素化修饰水平,导致其通过蛋白酶体途径降解蛋白酶体途径抑制剂可有效降低热激对GLI1降解的影响,而溶酶体途径抑制剂无明显影响,因此热激引起GLI1的降解是通过蛋白酶体途径实现的;HSP70抑制剂及HSP90抑制剂可抑制热激引起的GLI1降解;热激后GLI1蛋白的泛素化水平升高,进而发生降解;蛋白酶体抑制剂和热休克蛋白抑制剂可降低GLI1的泛素化修饰水平,抑制GLI1蛋白的降解。4.热激在体内可抑制食管癌细胞增殖能力及干性热激可有效抑制裸鼠成瘤能力,下调NANOG、SOX2、OCT4等的表达,抑制肿瘤细胞的干性。结论热疗可通过促进GLI1与HSP70的相互作用介导GLI1的泛素化修饰,最终经蛋白酶体途径降解,有效抑制食管癌细胞的增殖及肿瘤细胞的干性。