自20世纪40年代以来,抗生素因其具有的保健、促生长、预防和治疗疾病等作用,而被广泛应用于动物生产中。然而,抗生素的不合理使用,带来了一系列负面影响,例如:细菌耐药性、动物肠道菌群失调症、免疫机能降低、药物残留危害人体健康以及破坏生态平衡等。1986年,瑞典率先禁止在畜牧行业使用抗生素。2020年,我国开始禁止将促生长类药物添加剂加入商品饲料。但在全面禁抗背景下,如何确保畜禽健康是当前行业面临的重大挑战。抗菌肽是一类保护宿主不受微生物感染的天然免疫相关肽/蛋白,具有广泛的抗病原微生物活性,不易产生耐药性,有望成为一种理想的抗生素替代品。Bombyx mori Gloverin A2（BMGlv A2）是一种从家蚕（B.mori）中分离得到的诱导性抗菌肽,是一种小的阳离子线性α-螺旋肽。虽然抗菌肽在抑菌、抗炎以及免疫调控等方面的研究较多,但是有关BMGlv A2生物学功能的研究却鲜有报道。因此本研究开展了三个试验,首先合成并分析了BMGlv A2基因序列,并成功异源表达出了BMGlv A2,在此基础上分别以小鼠和IPEC-J2细胞为模型,研究了BMGlv A2在缓解大肠杆菌诱导肠道屏障炎性损伤中的作用和机制。主要研究结果如下:试验一BMGlv A2在大肠杆菌中的异源表达及其生物学特性研究试验通过全基因合成获得了BMGlv A2基因,并将BMGlv A2基因序列连接到表达载体p ET32（a+）中,转化表达宿主菌Origami B（DE3）后成功筛选出重组表达菌Origami B-p ET32-BMGlv A2。该重组菌株在28℃下经1.0 m M IPTG诱导8 h可获得大小约为22k Da的BMGlv A2蛋白（241μg/m L）,与理论大小相当。MALDI-TOF分析结果表明其氨基酸序列与家蚕自然分泌蛋白一致。体外抑菌实验结果表明,BMGlv A2对E.coli DH5α具有较明显的抑制作用,MIC值为32μg/m L。红细胞溶血与细胞毒性试验结果证实,BMGlv A2几乎没有溶血性和细胞毒性,初步判断BMGlv A2安全性较好,可用于后续体内外研究。试验二BMGlv A2对E.coli K88诱导小鼠肠道屏障炎性损伤的缓解作用肠道屏障完整性不仅影响着肠道的吸收功能,而且影响肠道抵御外来病原体侵袭的能力。研究表明,抗菌肽除了具有抑菌作用,还具有免疫调节等多种功能,在促进肠道先天免疫和健康中发挥了重要作用。本试验利用E.coli K88诱导小鼠肠道炎症模型,采用不同剂量的BMGlv A2（0,4,8 mg/kg）对小鼠进行预处理,然后用E.coli K88攻毒或不攻毒。预饲一周后,按照试验设计给所有试验鼠腹腔注射等体积的BMGlv A2或生理盐水,连续注射6天（每天一次）。在第7天早上,小鼠腹腔注射完BMGlv A2或生理盐水1 h后,给小鼠腹腔注射200μL无菌生理盐水或E.coli K88培养液(OD600=0.5),5 h后所有小鼠CO2麻醉处死。结果表明:E.coli K88攻毒不仅提高了血清炎性细胞因子IL-6和TNF-α的浓度,还增加了CREA和UREA的浓度（P＜0.05）。而BMGlv A2预处理可以通过降低血清炎性细胞因子水平和提高E.coli K88攻毒小鼠的代谢来缓解炎症反应,并减轻E.coli K88诱导的脾脏组织损伤,增加紧密连接蛋白ZO-1在十二指肠上皮的分布和丰度,从而改善肠道形态（降低十二指肠、回肠隐窝深度和提高十二指肠绒毛高度）（P＜0.05）。此外,BMGlv A2预处理可通过显著降低E.coli K88攻毒小鼠空肠黏膜炎性细胞因子（IL-1β、IL-6和TNF-α）和凋亡相关基因（Caspase8和Caspase9）的表达水平（P＜0.05）,提高与粘膜屏障功能相关的关键基因（MUC1和MUC2）以及葡萄糖转运蛋白（GLUT2）的表达水平（P＜0.05）。上述研究结果表明:E.coli K88攻毒可以导致小鼠肠道屏障炎性损伤。BMGlv A2可通过降低血清和空肠中炎症因子的产生,调节凋亡相关基因的表达,增加肠黏膜屏障功能基因的表达,进而改善其肠道健康。试验三BMGlv A2缓解肠上皮细胞炎性损伤的作用及其机制为进一步揭示BMGlv A2在缓解肠道屏障炎性损伤中的作用及其机制,构建了体外IPEC-J2细胞炎症模型。试验采用双因素试验设计,分别用BMGlv A2或NF-κB特异性抑制剂Bay预处理IPEC-J2细胞,然后用E.coli K88攻毒1 h。结果表明,BMGlv A2和抑制剂显著提高了E.coli K88攻毒下IPEC-J2细胞的活力并改善了紧密连接蛋白ZO-1的分布和丰度（P＜0.05）。同时,BMGlv A2和抑制剂不仅显著降低了IL-1β、IL-6和TNF-α等炎症细胞因子的表达水平,而且还降低了E.coli K88攻毒下细胞Caspase3的表达水平和凋亡率（P＜0.05）。此外,BMGlv A2和抑制剂显著降低了E.coli K88攻毒细胞中关键炎症相关信号蛋白IκBα和NF-κB的丰度。上述结果表明,BMGlv A2可以通过抑制NF-κB信号通路,减少炎症细胞因子分泌和细胞凋亡,从而缓解E.coli K88诱导的IPEC-J2细胞炎性损伤。综上所述,通过异源表达获得的BMGlv A2具有抑菌作用,且不影响细胞活性,进一步的体内外研究表明,在E.coli K88攻毒条件下,BMGlv A2可以通过调控NF-κB信号通路,抑制关键蛋白IκBα和NF-κB磷酸化,减少肠上皮细胞炎症因子释放,改善肠道紧密连接蛋白的分布和丰度,进而缓解E.coli K88导致的炎性损伤。上述研究结果不仅揭示了BMGlv A2缓解肠道炎性损伤的机理,还有望成为寻求改善动物健康的有效措施及新型抗生素替代品的研发提供新的思路。