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种子植物有性生殖过程的进化优势之一是产生了花粉。花粉可以保护和长距离运输精细胞(雄配子),使受精过程不再受水环境限制。在被子植物的双受精过程中,花粉粒从花药散出并粘附在雌蕊柱头;在柱头上复水后,花粉粒中的营养细胞从萌发孔突出,形成顶端极性生长的花粉管;花粉管穿过多层的雌蕊组织将两个不能游动的精细胞运送到胚囊;随后花粉管顶端在助细胞中破裂,释放出两个精细胞,一个精细胞与卵细胞融合发育成胚,另一个精细胞与中央细胞融合发育成胚乳。为了完成受精,花粉管必须在穿越雌蕊组织到达胚囊前不破裂,但在进入助细胞后又要及时破裂释放精细胞。这些过程受到植物特有的CrRLK1L(Catharanthus roseus RLK1-like)类受体激酶亚家族调控。许多研究证据表明,CrRLK1L-NADPH氧化酶途径参与调节拟南芥花粉管的生长与破裂,但相关的分子机制还尚未明朗。 通过反向遗传学方法,我们发现了一个水稻CrRLK1L亚家族的新成员Ruptured Pollen tube(RUPO)。RUPO特异的在水稻成熟花粉和萌发花粉中高表达。RUPO编码一个花粉管顶端质膜富集的单次跨膜蛋白。遗传学分析显示RUPO影响雄配子的传递,这导致杂合突变体rupo+/-的自交后代中没有纯合突变体出现。虽然形态观察显示rupo+/-产生的花粉粒在光镜和电镜下与野生型花粉粒无明显区别,但是花粉体外萌发实验显示rupo花粉管在萌发不久就破裂释放出细胞内含物而不是继续生长。与体外观察一致,苯胺蓝染色结果显示双位点CRISPR敲除植株(rupo-/-)的花粉粒与柱头的粘着能力显著降低,而且绝大多数花粉管在到达柱头底部之前就已经破裂,无法继续向胚珠生长。 我们采用酵母双杂交的方法筛选萌发花粉的cDNA文库以寻找可能与RUPO互作的蛋白。我们发现RUPO与高亲和性钾离子转运蛋白OsHAK在酵母中互作。这一直接的互作在下拉实验和免疫共沉淀实验中也得到进一步确认。另外,磷酸化实验显示RUPO的胞内区具有蛋白激酶活性,并且能够进行分子间自磷酸化。RUPO的近膜区对激酶区和OsHAK1的互作有抑制作用。RUPO自磷酸化后能和OsHAK1互作,但破坏其自磷酸化可以抑制RUPO与OsHAK1的互作。此外我们还用质谱鉴定出RUPO胞内区内的10个丝/苏氨酸磷酸化位点。 钾离子是植物细胞含量最为丰富的单价阳离子,也是花粉萌发和花粉管生长的必需矿物元素。钾离子与糖类是维持花粉管渗透压的主要调节物质。原子发射光谱对钾元素定量显示,纯合突变体花粉中的钾含量比野生型花粉升高了35%。因为高亲和性钾离子转运蛋白可以将细胞外的低浓度钾离子运输入胞内,因此在花粉管进入胚囊前,RUPO很可能抑制了钾离子转运蛋白向花粉管内转运钾离子的过程。 总之,我们第一次为类受体激酶调控钾离子转运蛋白提供了分子细胞学证据。我们提出RUPO-OsHAK这一信号模块可以通过调节钾离子相关的渗透压来影响花粉管的生长与稳定性。RUPO失活后会引起过多的钾积累到成熟花粉和花粉管,最终导致花粉管膨压升高并破裂。这一研究从全新的角度解释了双受精过程中花粉管破裂的分子机制。