目的:溃疡性结肠炎(UC)是炎症性肠病的一种,病情长且易反复发作,严重影响病人的生活质量。UC病人常伴有失眠和昼夜节律紊乱症状,这表明UC与生物钟关联密切。然而,UC是否受到生物钟的调控及其作用机制目前尚不明确。本论文研究旨在解析生物钟与UC之间的关联,阐明生物钟核心蛋白REV-ERBα对UC的调控效应及作用机制。具体研究目标如下:(1)建立小鼠UC模型,测定结肠基因表达谱,考察时钟基因表达变化;(2)建立生理型和基因型节律扰乱小鼠模型,评价节律扰乱对UC易感性的影响;(3)测定UC小鼠和节律扰乱小鼠中Rev-erbα的表达,并考察Rev-erbα基因敲除对UC易感性的影响;(4)明确REV-ERBα对UC的调控途径,阐明调控机制;(5)采用小分子激动剂靶向激活REV-ERBα,探讨REV-ERBα对UC的预防和治疗作用。方法:1.以C57BL/6J小鼠为实验对象,采用葡聚糖硫酸钠(DSS)构建小鼠UC模型。采用转录组测序技术测定UC模型小鼠和正常小鼠结肠基因在六个昼夜时点的表达。筛选UC小鼠和正常小鼠结肠的节律基因。进一步分析小鼠结肠中主要时钟基因的变化趋势,并采用荧光定量PCR(q PCR)法对测序的结果进行验证。2.采用慢性时差诱导法(Jet lag)建立生理型节律扰乱的小鼠模型。开展跑轮实验对节律扰乱模型进行验证。对正常小鼠和模型小鼠同时给予DSS建立小鼠UC模型。通过对UC小鼠进行全面表征,包括体重、疾病活动指数(DAI)、结肠长度、组织病理学评分和髓过氧化物酶(MPO)活性分析,探讨生理型节律扰乱对UC易感性的影响。此外,采用q PCR法测定小鼠结肠组织中Rev-erbα的表达。3.采用CRISPR/Cas9技术建立Bmal1基因敲除小鼠模型(基因型节律扰乱)。开展跑轮实验,PCR表型,q PCR和蛋白免疫印迹对节律扰乱模型进行验证。对正常野生型小鼠和Bmal1基因敲除小鼠同时给予DSS建立小鼠UC模型。通过对UC小鼠进行全面表征,包括体重、DAI、结肠长度、组织病理学评分和MPO活性分析,探讨基因型节律扰乱对UC易感性的影响。此外,采用q PCR法测定小鼠结肠组织中Rev-erbα的表达。4.采用CRISPR/Cas9技术建立Rev-erbα敲除小鼠模型。采用PCR表型和蛋白免疫印迹实验对Rev-erbα敲除小鼠模型进行验证。对野生型小鼠和Rev-erbα敲除小鼠同时给予DSS建立小鼠UC模型。通过对小鼠UC进行全面表征,包括体重、DAI、结肠长度、H&E染色评分和MPO活性分析,明确REV-ERBα对UC的调控效应。此外,采用酶联免疫吸附(ELISA)和蛋白免疫印迹实验考察Rev-erbα敲除对NLRP3炎症小体的影响。5.采用q PCR测定Nlrp3及相关炎性细胞因子基因在小鼠肝脏和结肠中的节律性表达,并考察Rev-erbα敲除对结肠Nlrp3节律性表达的影响。采用q PCR及蛋白免疫印迹技术,结合双荧光报告基因、凝胶迁移,染色质免疫共沉淀和免疫荧光等生物学实验阐明REV-ERBα对NLRP3炎症小体的转录调控机制。6.分别以野生型小鼠,Nlrp3敲除小鼠和Rev-erbα敲除小鼠为实验对象,采用DSS构建急性小鼠UC模型。采用小分子激动剂SR9009靶向激活REV-ERBα,探讨对UC的预防及治疗作用。结果:1.UC小鼠结肠时钟基因表达紊乱。转录组测序结果表明,UC小鼠结肠基因在基因组范围内发生显著变化。UC小鼠结肠中时钟基因节律表达紊乱,且大部分时钟基因(如Rev-erbα)表达下调。q PCR实验进一步证实了时钟基因的表达紊乱。2.节律扰乱小鼠对UC易感性增加。Jet lag诱导的生理型节律扰乱小鼠模型成功建立。和正常小鼠相比,Jet lag小鼠体重减轻更多,DAI评分、MPO活性和组织病理学评分更高,结肠长度更短。结果表明生理型节律扰乱小鼠对UC易感性增加。此外,与正常小鼠相比,Jet lag小鼠Rev-erbα表达降低。我们利用CRISPR/Cas9技术建立Bmal1敲除小鼠模型,并证明了敲除模型成功建立。通过分析相关指标(体重减轻程度、DAI评分、组织病理学评分、结肠长度和MPO活性),我们发现Bmal1敲除小鼠比正常小鼠UC发病情况更加严重。以上数据显示基因型扰乱小鼠对UC易感性增加。此外,与正常小鼠相比,Bmal1敲除小鼠Rev-erbα表达降低。3.Rev-erbα敲除小鼠对UC易感性增加,NLRP3炎症小体过度激活。我们利用CRISPR/Cas9技术建立了Rev-erbα敲除小鼠模型,并进一步证明敲除模型成功建立。通过分析相关指标(体重减轻程度、DAI评分、组织病理学评分、结肠长度和MPO活性),我们发现Rev-erbα敲除小鼠比正常小鼠UC发病情况更加严重。此外,与正常小鼠UC相比,Rev-erbα敲除小鼠结肠中NLRP3和1L-1β/1L-18蛋白表达增多。4.Nlrp3呈现节律性表达。Nlrp3在肝和结肠中均呈现明显的节律震荡。并且这种节律振荡与Rev-erbα表达趋势相反。在Rev-erbα敲除小鼠中,Nlrp3失去节律。这些数据表明,Nlrp3是时钟控制基因,并可能是REV-ERBα直接靶基因。5.REV-ERBα抑制NLRP3炎症小体活性。在腹腔免疫细胞(PMs)中,在脂多糖(LPS)处理前加药SR9009抑制NLRP3和IL-1βm RNA和蛋白质水平,而经LPS处理后加药SR9009无抑制作用。用LPS/三磷酸腺苷(ATP)短时间(30分钟)刺激,引起PMs中Caspase-1的活化,而SR9009处理对Caspase-1激活没有影响。这些数据表明,REV-ERBα在启动(priming)阶段而不是组装阶段抑制NLRP3炎症小体的激活。6.REV-ERBα抑制Nlrp3转录。在Raw264.7细胞和PMs中,REV-ERBα激活抑制LPS诱导的NLRP3 m RNA和蛋白表达,表明REV-ERBα对NLRP3表达有抑制作用。荧光素酶报告基因,染色质免疫沉淀(Ch IP)和凝胶迁移(EMSA)实验表明REV-ERBα通过与Nlrp3启动子的Rev RE(-1139/-1129 bp)结合而抑制Nlrp3转录活性。此外,单一Rev RE(-1139/-1129 bp)的突变不能消除SR9009对Nlrp3的转录抑制作用。而只有同时突变Rev RE和NF-κB结合位点才完全消除此抑制作用。荧光素酶报告基因、EMSA和免疫荧光实验表明,REV-ERBα的激活抑制了NF-κB信号通路。进一步的,我们发现REV-ERBα通过与p65启动子的Rev RE(-484/-474 bp)结合而抑制p65转录。7.靶向激活REV-ERBα预防和治疗UC。与溶剂组小鼠相比,SR9009处理组小鼠体重丢失较少、DAI指数较低、存活率更高、结肠更长、组织病理学指数和MPO活性较低。此外,在Nlrp3敲除小鼠或Rev-erbα敲除小鼠中,SR9009失去对UC的保护作用。总的来说,靶向激活REV-ERBα通过抑制NF-κB通路和NLRP3炎症小体从而预防和治疗UC。结论:1.经DSS诱导的UC小鼠基因在全基因组范围内表达紊乱,时钟基因失去节律;2.生理型和基因型节律扰乱小鼠对UC易感性增加;3.REV-ERBα在调控NLRP3炎症小体和UC发病过程中扮演重要角色;4.REV-ERBα通过抑制Nlrp3转录从而于启动阶段阻断NLRP3炎症小体激活;5.使用SR9009靶向激活REV-ERBα改善野生型小鼠UC症状,为UC的预防和控制提供新思路。6.生物钟调控溃疡性结肠炎的发现为中医学疾病昼夜节律变动提供了科学机制,为择时治疗奠定了基础。