哈萨克族食管癌发病的分子生物学机制研究 食管癌是人类最常见的十大恶性肿瘤之一，全世界食管癌每年发病人数超过30万，其中半数是中国人。据1974～1976年全国恶性肿瘤死亡回顾调查，新疆食管癌死亡率13.05/10万，在全国列第13位。而新疆哈萨克族食管癌死亡率为68.88/10万，部分地区高达90.75/10万。新疆哈萨克族是食管癌高发民族之一，具有明显的地区性和家族聚集性，食管癌成为本地区重点防治的恶性肿瘤。多年来对其流行病学、病因发病学进行了多学科的研究。结合多年以来的研究，综合应用细胞生物学、分子生物学等技术研究建立哈萨克族食管癌细胞系、研究其生物学特征及其干预实验、癌基因和抑癌基因与临床的变化，分两篇五个方面对哈萨克族食管癌进行了研究。 第一部分 细胞生物学 一、原代培养建立哈萨克族食管癌细胞系的研究 研究建立哈萨克族食管癌细胞系。 材料来源：从1999年10月至2001年3月，取新疆医科大学第一附属医院胸外科手术切除的哈萨克族食管癌新鲜癌组织标本6例，4男，2女，年龄45-63，临床诊断及病理诊断均为食管癌。术前均无放射治疗或化疗史。 RPMI1640培养基、15％胎牛血清培养液、RPMI1640培养基。 培养方法（原代培养技术）：术后1小时内取材，将手术切除食管癌组织，放置于装有Hank’s液的广口瓶中，半小时内送到细胞培养室。用Hank’s液充分洗涤。消毒器械修剪结缔组织及其附着物。Hank’s液浸泡2小时。眼科剪剪成2-3mm大小的组织块，用弯头吸管将剪好的有培养液的组织块贴于培养瓶（25ml）壁上，置于CO₂孵箱，37℃。将培养瓶底向上，加入培养液2ml，4h后接触培养液，24小时后，观察。每周更换两次培养液。 培养细胞的纯化：，倒置显微镜下，二 大后可见组织周围长出肿瘤细胞及成纤维细胞后，吸去旧液；用Hanks液洗3 次；然后加入消化液，37oC，10min，镜下可见成纤维细胞成圆形，癌细胞维持原状。吸出消化液，加＊。nrs液吹打细胞使成纤维细胞脱落，吸出旧液，组织块和癌细胞团用Hanks液轻轻漂洗3次，放入培养液CO。孵箱，37aC，每周换液2 次，处理1 次。纯化后的癌细胞添加表皮生长因 （ECF）25IU／ml促进其贴壁生长。 l 例获取原代细胞，成功率 16．7％（l／6）。成功的培养了哈萨克族食管癌原代细胞。为建立哈萨克族食管癌细胞系奠定了基础。 其余5例哈萨克族食管癌中：l例取材时可能污染，培养1大后，细菌污染，培养失败。2例细胞漂浮在培养液中，一直不贴壁，4周后弃取。2例，组织块周围组织周围长出一种点状物，围在组织快周围，细胞无法生长，4周后弃取。 培养前彻底清洗标本是培养成功的第一个关键。但若清洗过度，尤其是所加的抗真菌抗生素浓度过高，又会损伤细胞，导致培养失败。洗5遍合适。 细胞培养液的成分尤其是血清的浓度也是至关重要的，上皮细胞耐受低血清环境的能力较强，而成纤维细胞的耐受力较差，利用这个差异，用含15％胎牛血清的培养液可降低培养物中成纤维细胞的生长。从而进行纯化培养。而应用 10％一 15％小牛血清营养不够，上皮细胞牛长缓慢，同时纤维细胞生长相对加快，对培养组织生长不利。 上皮细胞纯化方法是利用两种细胞对消化液的耐受不同，掌握好消化时间是关键。在加入消化液后，CO。孵箱内，37t，smin后，可在倒置镜下观察，同时注意成纤维细胞变圆而肿瘤细胞无明显变化。在成纤维细胞去除后，加培养液时，培养液中加入表皮生长因子 （EGF），因为 EGF不但促进肿瘤细胞生长，也促进成纤维细胞生长，所以EGF在纯化后方能加入培养液。一次消化不能除尽成纤维细胞，所以，要多次反复纯化处理，同时，每周：1－4大换液1次。这样可以促进瘤细胞继续生长己获得较多肿瘤细胞。尚存在的问题，可能其它技术与条件控制不够理想，肿瘤细胞生长相对缓慢，建系困难。而下 1 一步重点放在探索更优培养条件与传代，建立哈萨克族食管癌细所 系，并进行生物学特征鉴定，为癌的生物医学在细胞和分子水平研多 应用奠定基础。 我们在研究中发现，如果组织周围长出一种点状物，该区域细胞 就无法生长。这种现象值得进一步研究。 二、食管癌细胞系（Eca9706）的生物学特征及番茄红素提耿物的干 预实验研究 体外长期培养的癌细胞是人们研究癌细胞生物学特性和药物、食 物对癌作用并得到筛选的有利工具，本文应用国内已建立了食管鳞癌 细胞系（EC；19706），完成生物学特征研究的方法。井应用番茄红素提 取物对其进行干预，研究番茄红素的抗癌效果及抗癌作用。 细胞系：人食管癌细胞系（Eca9706）出中国医学科学院肿瘤研 究所吴晏教授惠赠。受试物：番茄红素浸膏含量 69．6％(分光光度法