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红曲菌(Monascus spp.),又被称为红曲霉,其发酵产品——红曲米的应用记载可以追溯到汉朝。红曲菌可产生着色剂红曲色素(Monascus pigments,Mps)、降血脂成分莫纳可林(monacolin)L和降血压成分γ-氨基丁酸等多种有益次生代谢产物,因此红曲菌是生产天然食品着色剂、降血脂药品和降血压保健食品的重要生产菌种。其中,Mps是红曲菌主要次生代谢产物之一,它是黄、橙、红三类色素的混合物,对应的最大吸收峰分别为380 nm、470 nm和505 nm。但是1995年法国学者Blanc等发现某些红曲菌菌株也可产生一种肾脏毒素——桔霉素(citrinin,CIT),从而使红曲产品的安全性受到质疑。为了控制CIT产生,人们从筛选菌株,优化培养基组成与发酵条件,以及分子调控等方面,进行了大量研究,取得了较好的成效。光作为一种环境因子,对真菌的生长发育、初级与次级代谢产物产生、昼夜节律(circadian rhythm)等均有影响。光对真菌的影响是通过光受体(photoreceptor)接收光信号完成的。光受体是一类以发色团(chromophore)作为辅基的蛋白复合物,不同发色团能感知并捕捉不同波长的光,从而引发真菌对光的响应。到目前为止,真菌中已发现的光受体包括蓝、红和绿光受体,共3类。光对红曲菌也能产生影响,其中研究较多是蓝光和红光对其生长发育、Mps和CIT生产等的影响,但影响机理的研究报道很少。本研究以红色红曲菌(M ruber)M7为研究对象,首先基于其基因组,采用生物信息学方法,发现其基因组中存在1个红光受体基因(fungal phytochrome of Monascus,fphM)及 2 个绿光受体基因(Monascus new eukaryotic opsin,mnop-1,mnop-2),但没有发现普遍存在于其他真菌中的蓝光受体基因(whitecollar,wc)的同源基因,然后通过基因敲除、回补和过表达技术分别构建了fphM、mnop-1和mnop-2基因的敲除者、回补者和过表达者(以下简称为突变株),分析了红光和绿光对M7及其突变株生长发育、Mps和CIT产生的影响,探讨了其影响机理。具体研究结果如下:1红光、绿光受体基因及其功能结构域的分析以HMMER软件对M7全基因组进行了分析,发现其基因组中存在1个红光受体基因fphM和2个绿光受体基因mnop-1和mnop-2,但没有发现wc-1和wc-2在内的任何已知的蓝光受体基因的同源基因。对FphM、Mnop-1和Mnop-2功能结构域分析发现,FphM含有典型红光受体——真菌光敏色素(phytochrome)的PAS、GAF、PHY、HisKA、HATPase-C和RRD结构域,但PAS中缺少保守的半胱氨酸,FphM还包含一个跨膜区;Mnop-1和Mnop-2均含有真菌绿光受体——-细菌视蛋白(bacteriorhodopsin)的保守结构域和7个跨膜结构,但Mnop-1第7个跨膜区不含保守的赖氨酸。进化分析表明,Mnop-1属于 ORPs(opsin-related proteins)型视蛋白;Mnop-2 属于 NR(Neurosporarhodopsin)型视蛋白。2不同强度的红光和绿光对红曲菌M7的生物量、Mps及CIT产生的影响以避光(黑暗)为对照,以PDB为培养基,对红曲菌M7在100 lx、300 lx、500 lx强度的红光和绿光条件下,28℃培养至12d时的生物量,以及黄、橙、红色素与CIT的含量进行了分析。结果显示,与对照相比,仅300 lx红光可提高M7的生物量约19%,其中500 lx绿光对M7的生物量降低最明显,达18%,其它强度的红光和绿光对M7的生物量无影响。色素分析表明,3001x红光可增加M7胞内黄、橙、红色素含量,分别为7%、9%和9%,胞外黄、橙、红色素含量分别为10%、15%和15%,5001x的红光,3001x和500lx的绿光均可减少M7胞内外黄、橙、红色素的含量,其中5001x的绿光对胞内红色素的抑制作用最明显,达28%。1001x的红光和绿光不影响M7胞内外各种色素的含量。CIT的分析发现,不同强度红光均可降低M7的CIT产量,最高达20%;不同强度的绿光对CIT含量均无影响。由于300 lx的红光和绿光对红曲菌M7的影响最为明显,因此在后期实验中,为方便起见,选择3001x的红光和绿光作为光照条件。3红光、绿光受体基因敲除、回补和过表达菌株的构建及其特征分析根据同源重组原理,以M7为出发菌株,分别构建了fphM、mnop-1和mnop-2的敲除菌株ΔfphM、Δmnop-1和Δmnop-2,过表达菌株M7::PtrpC-fphM、M7::PtrpC-mnop-1和M7::PtrpC-mnop-2,回补菌株ΔfphM::fphM、Δmnop和 Δmnop-2mnp-2:mnop-2。将M7及这些突变株接种于表面平铺玻璃纸的PDA平板上,在300 lx红光和绿光照射条件下,28℃培养至12d,分析了其菌落生长速率(菌落直径)和显微形态,并收集菌丝体和菌落底部的PDA培养基,进行胞内外Mps和CIT的分析。3.1红光受体基因fphM突变株的特征分析fphM各突变株的菌落生长速率,以及菌丝体、闭囊壳、子囊孢子和分生孢子等显微特征与M7相比无差异;ΔfphM的生物量减少了 16%,M7::PtrpC-fphM的生物量增加了 28%,ΔfphM::fphM的生物量与M7无差异。色素分析表明,与M7相比,ΔfphM胞内黄、橙、红色素含量分别增加了 9%、15%和18%,胞外黄、橙、红色素含量分别增加了 11%、8%和17%;M7::PtrpC-fphM胞内黄、橙、红色素含量分别减少了 11%、12%和18%,胞外黄、橙、红色素含量分别减少了 9%、10%和9%,ΔfphM::fphM胞内外色素均与M7无差异。CIT 分析表明,ΔfphM的CIT 含量增加了 50%;M7::PtrpcfphM和ΔfphM::fphM的CIT含量与M7无差异。综上所述,fphM不影响红曲菌M7的生长发育,但于其生物量的积累正相关,与Mps和CIT的积累正相关。3.2绿光受体基因mnop-1突变株的特征分析mnop-1所有突变株的菌落生长速率,菌丝体、闭囊壳、子囊孢子和分生孢子等显微特征,以及生物量与M7无差异。色素分析表明,与M7相比,Δmnop-1的胞内黄、橙、红色素含量分别增加了 21%、23%、18%,胞外黄、橙、红色素含量分别增加了 17%、11%、15%,M7::PtrpC-mnop-1胞内黄、橙、红色素含量分别减少了 26%、22%、26%,胞外黄、橙、红色素含量分别减少了 23%、22%、31%;Δmnop-1::mnop-1胞内外色素与 M7 无差异。CIT分析表明,Δmnop-1的CIT含量增加了 23%,M7::PtrpC-mnop-1的CIT含量减少了 19%;Δmnop-1::mnop-1的 CIT 含量与 M7 无差异。以上结果表明,mnop-1与红曲菌M7的生长发育和生物量的积累不相关,对Mps、CIT的积累均有一定负相关。3.3绿光受体基因mnop-2突变株的特征分析mnoop-2的所有突变株的菌落生长速率,以及菌丝体、闭囊壳、子囊孢子和分生孢子等显微特征和生物量与M7无差异。色素分析表明,Δmnop-2的胞内黄、橙、红色素含量分别减少了 29%、20%和23%,胞外黄、橙、红色素含量分别减少了 19%、14%和23%,M7::PtrpC-mnop-胞内黄、橙、红色素含量分别增加了 23%、26%和21%,胞外黄、橙、红色素含量分别增加了 34%、17%和16%。Δmnop-2::mnop-2胞内外各色素与M7无差异。CIT分析表明,mnop-2所有突变株CIT含量与M7无差异。综合以上实验结果,mnop-2与红曲菌M7的生长发育、生物量与CIT的积累不相关,与Mps的积累有一定的正相关。