目的:索拉非尼是当前国内用于晚期肝细胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）病人的首选靶向药物,然而,许多HCC病人对索拉非尼治疗反应不佳或在治疗数月后就产生耐药性。HCC病人对索拉非尼的耐药性多在治疗6个月后出现。之前对于肿瘤靶向治疗的研究主要聚焦于凋亡、坏死、自噬性死亡等细胞死亡形式。然而,肿瘤细胞可以通过增加耐药表型和促进Ras等信号通路的表达以避免凋亡、坏死的发生,并且基于凋亡、自噬等机制研发的药物在临床试验时效果也并不理想,这表明肿瘤细胞可能通过其他形式促进了自身对化疗药物的耐药性。因此了解肿瘤细胞的死亡方式,对于拮抗肿瘤耐药具有重要的意义。当前研究表明,肿瘤耐药与铁死亡具有紧密的联系。铁死亡是一种细胞内铁离子过度积累诱导的活性氧簇（reactive oxygen species,ROS）失衡,进而诱导细胞膜和细胞器的膜脂结构过氧化、破裂的激烈的死亡形式,铁死亡的同时伴随着抗氧化酶功能的缺失,例如谷胱甘肽过氧化物酶4（glutathione peroxidase 4,GPX4）的表达受到抑制。肿瘤耐药中表型突出的高表达基因例如GPX4、内核因子红细胞2相关因子2（nuclear factor erythroid-2-related factor 2,NRF2）等是铁死亡的核心负调控因子,且铁死亡已经逐渐应用于实验化合物和临床药物的研究。此外,肿瘤细胞固有的高铁离子含量与丰富的多不饱和脂肪酸反应,为铁死亡提供了有利的物质储备。因此,利用铁死亡靶向治疗肿瘤耐药具有一定的优势。当前多种药物包括索拉非尼可以诱导肿瘤细胞发生铁死亡,通过探究铁死亡的机制及其在肿瘤细胞中的作用有望为HCC的靶向治疗提供新的有效的策略。铁硫结构域（C-X-C-X2-（S/T）X3-P-X-C-D-G-（S/A/T）-H,CDGSH）蛋白家族在调节铁离子、活性氧稳态和细胞自噬的过程中发挥着关键作用。CDGSH铁硫域2（CDGSH iron-sulfur domain 2,CISD2）作为该蛋白家族的成员,曾被证明与许多癌症的发生发展有关。然而,CISD2在HCC耐药中的研究目前尚无报道。研究表明,自噬在肿瘤细胞稳态和铁死亡中发挥重要作用,但是自噬对于肿瘤耐药和铁死亡的平衡是当前研究的难点。本研究旨在探讨CISD2在索拉非尼耐药中的作用以及对铁死亡的调控机制,并探究CISD2通过调控自噬促进HCC耐药细胞抵抗铁死亡,为HCC索拉非尼耐药的靶向治疗提供新的策略。研究方法:1、本研究分析铁死亡负调节基因在基因表达综合数据库（gene expression omnibus,GEO）耐药样本中的表达。并在癌症基因组图谱（the cancer genome atlas,TCGA）数据库比较369例HCC病人的肿瘤组织和50例HCC病人癌旁组织的RNA序列数据,Kaplan-Meier法进行病人的生存曲线分析,明确了CISD2在肝细胞癌中的表达与病人预后的相关性,在细胞层面利用实时荧光定量多聚核苷酸链式反应（real-time quantitative polymerase chain reaction,Real-time PCR）和免疫印迹试验（western blot）探究CISD2在HCC细胞系中表达。2、为构建索拉非尼耐药模型,本研究利用浓度梯度培养法构建HCC索拉非尼耐药细胞系,细胞活性试剂盒（cell counting kit-8,CCK-8）检测不同浓度索拉非尼处理下细胞活性,western blot检测索拉非尼靶点细胞外调节蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases,ERK）及磷酸化ERK（Phospho-ERK,p-ERK）的表达。3、为明确索拉非尼促进HCC细胞发生铁死亡,本研究利用CCK-8检测索拉非尼与铁抑素-1（ferrostatin-1,Fer-1）、去铁胺（deferoxamine,DFO）、凋亡阻断剂（Z-Val-AlaAsp（OMe）-FMK,ZVAD-FMK）、坏死磺胺（necrosulfonamide,NSA）处理后细胞增殖水平的变化,流式细胞术检测细胞凋亡水平。4、为明确CISD2对HCC耐药细胞的影响,本研究利用应用脂质体转染技术在耐药细胞中构建稳定低表达CISD2的HCC细胞系,Real-time PCR和western blot检测转染后CISD2的表达,CCK-8法检测索拉非尼与Fer-1、DFO、ZVAD-FMK、NSA处理下耐药细胞活性的变化,流式细胞术检测索拉非尼耐药细胞的凋亡水平。5、为明确敲低CISD2对HCC耐药细胞铁死亡的影响,本研究利用二氯二氢荧光素-乙酰乙酸酯（2,7-Dichlorodihydrofluorescein diacetate,DCFH-DA）染色法检测耐药细胞ROS表达,脂质过氧化试剂盒检测丙二醛（malondialdehyde,MDA）的表达,微量还原型谷胱甘肽试剂盒检测谷胱甘肽（glutathione,GSH）的表达,钙黄绿素乙酰氧基甲酯（calceinacetoxymethyl ester,Ca-AM）荧光探针和流式细胞术检测铁离子的表达水平。6、为明确CISD2通过调控自噬影响HCC耐药细胞铁死亡,本研究利用基因功能富集分析（gene set enrichment analysis,GSEA）网站对HCC数据库样本中的CISD2进行功能富集分析,western blot检测CISD2敲低后微管相关蛋白1A/1B-轻链3（microtubule-associated proteins 1A/1B light chain 3,LC3）的表达水平,免疫荧光技术（immunofluorescence technique,IFT）检测LC3荧光斑点数量,western blot检测敲低CISD2对哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin,m TOR）通路相关蛋白磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K）、磷酸化PI3K（phospho-PI3K,p-PI3K）,丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶AKT（serine/threonine-protein kinase AKT,AKT）、磷酸化AKT（phospho-AKT,p-AKT）,m TOR、磷酸化m TOR（phospho-m TOR,p-m TOR）的蛋白表达水平。台盼蓝染料检测敲低CISD2后耐药细胞在3-甲基腺嘌呤（3-Methyladenine,3-MA）或巴佛洛霉素A1（bafilomycin A1,Baf A1）处理下细胞死亡水平的改变情况,流式细胞术检测抑制自噬后HCC耐药细胞ROS、铁离子表达水平,试剂盒检测MDA、GSH表达水平。7、为明确CISD2通过自噬对铁死亡的调控与Beclin1相关,Real-time PCR检测敲低CISD2后自噬相关基因的表达,western blot检测敲低CISD2后Beclin1的表达,脂质体转染技术构建Beclin1稳定低表达的HCC耐药细胞,Real-time PCR和western blot检测敲低Beclin1后的表达,在共处理CISD2抑制剂吡格列酮（pioglitazone,Pg）和敲低Beclin1后,western blot检测自噬相关蛋白LC3 II/I的表达水平,免疫荧光检测LC3荧光斑点数量,脂质过氧化试剂盒检测MDA的表达。结果:1、铁死亡负调控基因在GEO索拉非尼耐药样本中的表达显示CISD2相对高表达,TCGA数据库显示CISD2在HCC中显著上调,Kaplan-Meier生存分析表明CISD2高表达病人的生存率低于低表达病人的生存率,Real-time PCR和western blot结果表明CISD2在HCC细胞中的表达高于正常肝细胞系。2、浓度梯度法构建的耐药细胞在不同浓度索拉非尼处理下,相对非耐药细胞活性具有一定的提高,耐药细胞p-ERK表达不能被索拉非尼抑制。3、索拉非尼诱导HCC细胞活性降低能被铁死亡阻断剂Fer-1、DFO所抑制,而不能被ZVAD-FMK和NSA所抑制,流式细胞仪检测索拉非尼诱导HCC细胞凋亡的效应并不如凋亡促进剂星形孢菌素（staurosporine,STS）的处理效果明显。4、在不同浓度索拉非尼处理下,敲低CISD2明显促进了耐药细胞活性的降低,在敲低CISD2与索拉非尼处理下,耐药细胞活性水平的降低能被Fer-1、DFO所逆转,而不能被ZVAD-FMK和NSA所抑制,流式细胞仪结果表明敲低CISD2后凋亡效果并不明显,敲低CISD2后促进了索拉非尼诱导的耐药细胞ROS表达增加、脂质过氧化物MDA表达增加、细胞内铁离子聚集,而GSH的表达没有发生明显变化。5、GSEA功能富集分析表明HCC中CISD2主要参与调控自噬,western blot结果显示敲低CISD2后自噬相关蛋白LC3 II/I的表达水平显著增加,LC3的荧光斑点显著增加,western blot结果表明敲低CISD2后,耐药细胞中p-PI3K,p-AKT,p-m TOR蛋白没有发生显著变化。6、台盼蓝染色法结果表明3-MA和Baf A1处理抑制了一定水平的细胞死亡,其中3-MA发挥了更强的作用,western blot结果表明在CISD2敲低组中,经3-MA处理后LC3 II/I的表达水平被显著抑制,并且LC3的荧光斑点被显著抑制,流式细胞仪分析显示3-MA处理组耐药细胞MDA、ROS表达水平显著降低,铁离子表达水平显著降低,但是GSH表达水平的变化不受3-MA处理的影响。7、Real-time PCR和western blot结果表明敲低CISD2促进自噬相关基因Beclin1的表达,western blot结果表明索拉非尼和Pg联合处理后LC3 II/I表达水平显著增加,但与Beclin1 sh RNA联合处理可降低LC3 II/I的表达水平,免疫荧光结果显示,在索拉非尼和Pg联合处理后,LC3荧光斑点显著增加,同时敲低Beclin1后LC3荧光斑点减少;台盼蓝染色法结果显示与索拉非尼和Pg联合处理相比,Beclin1基因敲低显著降低了细胞死亡率,与单纯抑制CISD2相比,联合敲低Beclin1相对降低了耐药细胞MDA的表达水平。结论:1、CISD2在HCC组织中相对高表达且与患者的不良预后相关。2、索拉非尼主要促进HCC细胞发生了铁死亡。3、敲低CISD2后,促进了索拉非尼耐药细胞发生铁死亡。4、敲低CISD2促进了索拉非尼耐药细胞自噬,并通过自噬参与促进铁死亡。5、CISD2通过调控Beclin1参与对索拉非尼诱导铁死亡的抵抗。6、CISD2抑制剂与索拉非尼联合处理可显著抑制HCC耐药细胞的活性,有望为HCC的靶向治疗提供一定的策略。本研究证实了CISD2通过抑制铁死亡介导HCC细胞索拉非尼耐药,且抑制CISD2可以通过Beclin1依赖的自噬参与促进耐药细胞铁死亡的发生,CISD2有望成为拮抗HCC耐药的治疗靶点,为HCC临床诊疗提供一定的理论依据。