论文部分内容阅读
近年来，肿瘤组织中抑癌基因启动子区CpG岛的异常甲基化成为肿瘤研究领域中一个新的研究热点，认为是除突变、缺失以外导致抑癌基因失活的第三条通路。子宫内膜癌是女性生殖道常见肿瘤之一，虽然随着诊疗水平地提高，早期患者5年生存率最高可达80～90％，但期别晚分化差的内膜癌患者5年生存率只有5-15％，合并雌孕激素受体失表达者预后更差，而且孕激素受体失表达常常使得这部分患者的孕激素治疗难以奏效，所以子宫内膜癌孕激素受体的失表达及其发生机制备受关注。在孕激素受体亚型水平上，有研究表明孕激素受体B亚型(progesterone receptor B，PRB)在子宫内膜癌中的失表达率明显高于A亚型(progesterone receptor A，PRA)，并导致拮抗雌激素效应能力的下降，而在探讨PRB失表达机制的研究中尚未见到基因突变缺失的报道。对此，国外学者就第三条抑癌基因失活途径探讨了子宫内膜癌中PRB失表达的原因，发现PRB基因启动子区存在CpG岛甲基化，并在多种PRB失表达的子宫内膜癌细胞系上以去甲基化试剂成功诱导了PRBmRNA复表达。国内尚无此类研究的报道。本研究采用甲基化特异性PCR(methylation-specific PCR，MSP)的方法对子宫内膜癌患者癌组织中PRB基因启动子区CpG岛甲基化发生率进行了检测，并在蛋白水平上观察经去甲基化试剂处理后，PR阴性的子宫内膜癌细胞系Heccl-1(human endometrial carcinoma cell line-1)PRB的表达状况的改变，从而间接探讨子宫内膜癌PRB失表达机制，并为去甲基化药物应用于子宫内膜癌的临床治疗提供实验依据。郑州大学2003年硕士研究生毕业论文子宫内膜癌孕激素受体B亚型基因启动子区CPG岛甲基化研究2.材料与方法2.1材料26例子宫内膜癌标本来自郑州大学医学院第一附属医院1997一1999年归档的石蜡块。7例正常子宫内膜来自同期因子宫肌瘤手术切除子宫内膜之石蜡块标本。HecC卜1子宫内膜癌细胞系来自山东省肿瘤防治研究院2000年自建细胞系，其PR阴性。本实验用细胞系为Heccl一第63代细胞。2.2方法2.2.1子宫内膜癌组织PRB基因启动子区CPG岛甲基化发生率检测:利用UNI奋10柱式小量基因组DNA抽提试剂盒提取石蜡切片中的基因组DNA后，采用甲基化特异的PCR方法检测PRB基因启动子区CPG岛甲基化状况。该方法应用亚硫酸氢钠处理基因组DNA，将所有无甲基化修饰的胞嗜淀转变为尿嗜睫，而尿嗜陡在后续的PCR中被胸腺嗜吮取代，此过程中甲基化胞嗜睫维持不变。据此变化，于富含CPG的PRB启动子区，设计出针对存在CPG甲基化DNA特异敏感的引物PRB一M，以亚硫酸氢盐处理过的DNA为模板进行扩增。PCR产物采用琼脂糖凝胶电泳，澳化乙睫染色，紫外光透射下观察来鉴定 根据特异性产物的有无来确定目的DNA区域CPG的甲基化情况。2.2.25杂氮脱氧胞昔对Heccl一子宫内膜腺癌细胞系PRB表达影响的研究:取第63代Heeel一l细胞系，选IMDM(iseove modified dulbeeeo medium)为培养基，于第1、3、5天加用甲基转移酶抑制剂5杂氮脱氧胞昔，药物终浓度分别为1“g/m1、2 pg/ml、4协g/ml、8，g/ml，第2、4天更换为无药培养基，同时设立PBS代替药物的试验对照组，第6天收获细胞，制备单细胞悬液，每组取8张滴片丙酮固定后采用抗PRB的单克隆抗体按常规免疫组化的方法检测Heccl一1细胞系PRB蛋白表达状况。与PBS代替一抗的空白对照相比，胞核部位出现明显的棕黄色信号为表达PRB蛋白的典型阳性细胞，每个滴片在高倍镜下计数100个细胞，典型阳性细胞<5%为阴性滴片，典型阳性细胞数占5一5既为阳性滴片，典型阳性细胞>50%为强阳性滴片。2.3统计学方法:采用SPSS统计软件包四格表精确概率法及成组设计多个样本比较的秩和检验方法进行统计处理，以Q=0.05作为检验水准。 2郑州大学2003年硕士研究生毕业论文子宫内膜癌孕激素受体B亚型基因启动子区cpG岛甲基化研究3.结果3.1 26例子宫内膜癌患者其癌组织中13例存在PRB启动子区CpG岛甲基化，7例正常子宫内膜组织无一例存在PRB基因启动子甲基化，两组比较差异有显著性 (只Q .QS)。3.2 15例中、低度分化的子宫内膜癌患者组中n例存在PRB基因启动子区CPG岛甲基化，高分化内膜癌患者组n例中有2例存在该甲基化现象，两组比较差异有显著性(尸<0 .05)。在有无淋巴结转移，有无肌层浸润及各病理类型组别间，该甲基化发生率无统计学差异(尸>0 .05)。3 .3药物处理前及PBS代替药物的实验对照组Heccl一l细胞系PRB蛋白检测均为阴性。3.45杂氮脱氧胞昔不同药物终浓度的Heccl扭细胞系实验组PRB蛋白均呈不同强度的表达，与实验对照组之间比较差异有极显著性(只0.001)，各处理组之间PRB表达强度差异无显著性(尸>0 .05)。4.结论4.1 PRB基因启动子区C两岛甲基化在子宫内膜癌的发生发展中为一频发的重要分子事件，该甲基化发生率与中低分化的子宫内膜癌相关。4.2子宫内膜癌细胞系Heccl一1的PRB失表达可{以被去甲基化药剂5杂氮脱氧胞昔逆转而重新恢复表达。 提示子宫内膜癌患者癌组织中PR