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心肌纤维化(myocardial fibrosis,MF)可使心肌僵硬度增加,心脏收缩、舒张功能受损,严重威胁患者的生活质量,积极开展MF的防治研究对改善患者预后具有重要意义。miRNA是由20-22个核苷酸构成的非编码单链小RNA,可通过对靶mRNA的降解或抑制转录后翻译过程发挥调控功能。越来越多的研究显示miRNAs在心血管疾病中发挥着重要作用。课题组前期研究表明,扶正化瘀胶囊(FZHY)可减小心肌梗死面积、改善心功能,具有防治心肌纤维化的作用,但其作用机制尚不明确。因此,本研究制备大鼠急性心肌梗死模型,观察FZHY对心梗后MF中差异miRNAs的干预作用,以期从miRNA的角度揭示FZHY抗心梗后心肌纤维化的作用机制。目的:揭示心梗后心肌纤维化中差异miRNAs表达谱的变化;以miRNA为切入点,探讨FZHY抗心梗后心肌纤维化的可能作用机制。方法:采用左冠脉前降支结扎术制备大鼠急性心肌梗死模型,随机分为模型组和FZHY组,每组再随机分为术后4周和术后8周两组。假手术组只穿线不结扎。每组各5只。FZHY组给予扶正化瘀胶囊0.4 g/(kg·d)灌胃,假手术组和模型组给予等体积去离子水,每日1次,分别连续4周和8周。采用HE和Masson染色检测心肌组织病理学变化。基因芯片分别检测术后4周和术后8周大鼠的假手术组与模型组之间差异miRNAs表达谱。TargetScan和microRNAorg两个数据库共同预测差异miRNAs的靶基因,并通过DAVID在线工具对共同的靶基因进行GO和KEGG富集分析。实时荧光定量PCR法验证基因芯片检测结果,以及FZHY对差异miRNAs表达的影响。然后筛选FZHY可能靶向调控的miRNA,并通过DAVID在线工具进一步预测其靶向信号通路。STRING数据库和Cytoscape软件对pathway中靶基因对应的蛋白进行蛋白互作网络(PPI)分析。结果:(1)与假手术组相比,术后4周和术后8周的模型组大鼠心肌胶原容积分数(CVF)增加(P<0.01),心肌组织被破坏,心肌细胞破碎,胶原大量聚集,纤维化程度较重。与模型组相比,FZHY组CVF减小(P<0.01),心肌组织排列比较整齐,胶原相对减少,程度减轻。(2)与假手术组相比,术后4周模型大鼠中miR-132-3p、miR-140-3p、miR-140-5p、miR-15 5-5p、miR-199a-3p、miR-199a-5p、miR-21-5p、miR-214-3p、miR-221-3p、miR-222-3p、miR-31a-3p、miR-31a-5p、miR-335 表达上调(FC≥ 2,P≤0.05)。这 13 个 miRNAs 共得2155个靶基因。GO分析显示差异miRNAs可影响细胞质、内质网、线粒体等细胞成分;调控蛋白质结合、蛋白激酶结合、转录因子结合等分子功能;参与凋亡过程、老化、细胞对葡萄糖饥饿的反应等生物过程(P<0.01)。KEGG分析显示差异miRNAs靶向63条相关通路包括胰岛素信号通路、胰岛素抵抗、MAPK信号通路等(P<0.05)。(3)与假手术组相比,术后8周模型大鼠中9个miRNAs呈差异表达(FC≥ 1.2,P ≤ 0.05)。其中,miR-106b-5p、miR-10b-5p 表达上调,miR-20b-5p、miR-3 0e-3p、miR-352、miR-378a-5p、miR-378b、miR-425-5p、miR-483-3p 表达下调。这 9 个 miRNAs 共得 990个靶基因。GO分析显示差异miRNAs可影响细胞质、细胞外泌体、高尔基体等细胞成分;调控蛋白质结合、蛋白激酶结合、蛋白激酶活性等分子功能;参与蛋白质转运、老化、对葡萄糖的反应、凋亡过程等生物过程(P<0.01)。KEGG分析显示差异miRNAs靶向调节20条相关通路包括TNF信号通路、TGF-β信号通路、MAPK信号通路等(P<0.05)。(4)实时荧光定量 PCR 检测结果显示,miR-140-3p、miR-140-5p、miR-199a-3p、miR-199a-5p、miR-21-5p、miR-214-3p、miR-221-3p、miR-222-3p、miR-31a-3p、miR-31a-5p在术后4周大鼠中的表达趋势与芯片结果一致。而且除miR-140-3p外,其余9个miRNAs在模型组中的表达均明显高于假手术组(P<0.05或P<0.01)。(5)FZHY 可降低术后 4 周模型大鼠中 miR-140-5p、miR-199a-3p、miR-199a-5p、miR-214-3p、miR-221-3p、miR-222-3p 和 miR-31a-3p 的表达,但差异均无统计学意义(P>0.05)。(6)miR-199a家族最有可能是FZHY直接靶向的miRNA。miR-199a-3p/5p可得378个靶基因。GO分析显示miR-199a可影响线粒体外膜、细胞质、高尔基体等细胞成分;调控蛋白质结合、蛋白激酶结合、激酶活性等分子功能;参与缺氧、胰岛素、氨基酸、脂肪酸代谢等生物过程(P<0.01)。KEGG分析显示miR-199a靶向调节10条相关通路包括胰岛素信号通路、胰岛素抵抗、PI3K-Akt信号通路等(P<0.05),其中胰岛素信号通路与miR-199a-3p/5p关系最为密切。PPI分析显示mTOR作为中心蛋白在胰岛素信号通路中的意义最大。结论:(1)在心梗后心肌纤维化的不同时期均有不同的miRNAs参与,生物信息学分析显示这些差异miRNAs靶向调控多种功能和信号通路,为进一步探索心肌纤维化的形成机制提供了思路。(2)结合扶正化瘀胶囊对差异miRNAs表达的影响,推测调节miR-199a-3p/5p靶向Insulin-PI3K/Akt-mTOR信号通路可能是扶正化瘀胶囊在基因水平上改善心梗后心肌纤维化的作用机制。