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背景关节软骨病变作为一个基本的病理过程,几乎参与了所有临床常见的关节疾病病理变化早期阶段。由于软骨组织内缺乏血管和淋巴分布,软骨细胞含量少,缺少细胞分化所必须的祖母细胞且包埋于稠厚的细胞外基质中,迁徙难度大,无法有效移动到损伤部位参与修复,因此其自我修复能力非常差,即使是微小的软骨缺损也难以自然修复。目前临床上对于关节软骨损伤主要以手术治疗为主,包括：关节镜修复术、微骨折术、自体软骨移植术和自体软骨细胞移植术等。然而这些治疗方法临床疗效不够理想,且存在许多不足之处。组织工程技术的出现,为关节软骨损伤的治疗提供了一种全新的思路和方法。软骨组织工程的研究内容主要包括三个方面：种子细胞、细胞生长因子和支架材料。其中支架材料为种子细胞提供获取营养、气体交换、废物排泄和生长代谢的场所,种子细胞附着于支架材料上不断更新、代谢,分化繁殖新的细胞,细胞生长因子参与调控种子细胞代谢,促进细胞增殖、分化等,最终形成与正常软骨组织在形态和功能上完全一致且能正常代谢、增殖的新生软骨组织。脂肪干细胞(adipose-derived stem cells, ADSCs)具有以下优点：1.取材方便,创伤小,并发症少,病人易于接受；2.分离培养简单,容易获得；3.获取效率高,每1g脂肪组织可以获得5×103干细胞,是1g骨髓组织获得干细胞的300倍,非常适合作为种子细胞。胰岛素样生长因子-1(insulin-like growth factor-1, IGF-1)与软骨发育和再生关系密切,在ADSCs定向分化为软骨细胞的过程中起到了非常关键的作用,它能够促进软骨细胞增殖、再分化,保持软骨细胞的特异表型并抑制程序性凋亡,同时促进软骨基质合成代谢,抑制软骨基质的降解,是体内调节软骨蛋白聚糖合成最重要的生长因子。基质细胞衍生因子-1(Stromal cell-derived factor-1, SDF-1)又被称为“归巢趋化因子”,在启动和促进干细胞归巢方面具有重要的作用。温敏型水凝胶具有微创可注射性,无毒性,良好的生物相容性,高含水量和高亲水性,注射入体内后能够在体温下快速的原位转变为凝胶状,而且能为种子细胞提供良好的生长环境。本实验制备了载IGF-1PLGA缓释微球和PLGA-PEG-PLGA温敏型水凝胶,研究了其理化性能及对体外培养的ADSCs的增殖与分化的促进作用,并联合ADSCs和SDF-1构建了水凝胶复合体,观察其对兔关节软骨缺损的修复效果。从而为其将来的临床研究提供实验依据。本课题主要分三部分：(1)采用W/O/W乳化-溶剂挥发法制备IGF-1PLGA微球,采用开环聚合法制备PLGA-PEG-PLGA水凝胶,扫描电镜对PLGA微球、水凝胶及载微球水凝胶进行形貌观察,检测其载药量和包封率,绘制药物释放曲线,并对水凝胶进行胶凝化观察；(2)分离培养兔ADSCs,观察IGF-1PLGA微球/SDF-1/PLGA-PEG-PLGA水凝胶复合体对其增殖过程的影响及对其软骨方向分化的作用；(3)以IGF-1PLGA微球/SDF-1/PLGA-PEG-PLGA水凝胶复合体作为载体搭载ADSCs,将其植入兔股骨髁软骨缺损处,观察研究其修复兔关节软骨缺损的效果。第一部分IGF-1PLGA缓释微球和PLGA-PEG-PLGA温敏型水凝胶的制备目的观察分别采用W/O/W乳化-溶剂挥发法和开环聚合法能否成功制备适合软骨组织工程研究用的IGF-1PLGA微球和PLGA-PEG-PLGA水凝胶。方法采用W/O/W乳化-溶剂挥发法制备IGF-1PLGA微球,采用开环聚合法制备PLGA-PEG-PLGA水凝胶,并制备其复合体。检测IGF-1PLGA微球的载药量和包封率,观测PLGA-PEG-PLGA水凝胶的温敏性质,分别观察IGF-1与SDF-1的体外释放性质,透射电镜及扫描电镜观察各自的形貌特征,以及观察水凝胶复合体的胶凝化性能。结果成功制备IGF-1PLGA微球,PLGA-PEG-PLGA水凝胶及其复合体。检测IGF-1PLGA微球的载药量平均值为0.0622%,包封率平均值为81.8%。质量分数为20%的PLGA-PEG-PLGA水凝胶胶凝温度为33.2±0.1℃。复合体中IGF-1和SDF-1在第1天的突释率分别为14.4%和27.7%。透射电镜和扫描电镜显示PLGA微球直径大小为50-801-μm在水凝胶中形态保持良好。水凝胶复合体在37℃时3分钟即可胶凝化。结论我们制备的IGF-1PLGA微球/SDF-1/PLGA-PEG-PLGA水凝胶复合体胶凝性质良好,能够持续缓释SDF-1和IGF-1双生长因子,能够满足软骨组织工程研究的需要。第二部分IGF-1PLG徽球/SDF-1/PLGA-PEG-PLGA水凝胶复合体对兔ADSCs增殖、分化的影响目的研究IGF-1PLGA微球/SDF-1/PLGA-PEG-PLGA水凝胶复合体对体外培养的兔ADSCs增殖过程的影响及对其软骨方向分化的作用。方法取兔腹股沟部脂肪组织分离培养ADSCs并绘制细胞生长曲线。使用第3代ADSCs,分别观察其成骨诱导、成软骨诱导和成脂诱导分化能力。MTT法检测IGF-1PLGA微球、载SDF-1PLGA-PEG-PLGA水凝胶及其复合体对兔ADSCs增殖的影响。实时定量PCR检测它们对/ADSCs SOX-9、Collagen Ⅱ和Aggrecan基因表达的影响。Western Blot检测它们对ADSCs SOX-9、Collagen Ⅱ和Aggrecan等相关蛋白表达的影响。结果分离培养的ADSCs的成骨诱导、成软骨诱导和成脂诱导分化均成功。PLGA微球和PLGA-PEG-PLGA水凝胶对兔ADSCs的细胞活性和增殖无不良影响,IGF-1PLGA-教球和水凝胶复合体在第3、7天对ADSCs具有较为明显的增殖促进作用。与IGF-1PLGA微球和水凝胶复合体共培养的ADSCs在培养第7、14天时SOX-9、Collagen Ⅱ和Aggrecan基因表达显著增高,各组蛋白表达结果与PCR结果一致。结论我们制备的IGF-1PLGA微球/SDF-1/PLGA-PEG-PLGA水凝胶复合体不仅是一个良好的载药系统,其三维立体结构及高含水性还能为种子细胞提供优良的细胞生长环境,对ADSCs的成软骨诱导分化促进作用明显,在软骨组织工程中将有广阔的应用前景。第三部分ADSCs/IGF-1缓释微球/SDF-1/温敏型水凝胶修复兔关节软骨缺损的研究目的以IGF-1PLGA微球/SDF-1/PLGA-PEG-PLGA水凝胶复合体作为载体搭载ADSCs,将其植入兔股骨髁软骨缺损处,观察研究其对兔关节软骨缺损的修复作用。方法将50只新西兰大白兔随机分为5组：对照组：手术造成股骨髁软骨缺损,不做任何处理；hydrogel+MS组：兔股骨髁软骨缺损处植入已胶凝化的,含10mg/ml IGF-1PLGA微球的PLGA-PEG-PLGA水凝胶,不加SDF-1; hydrogel+SDF-1组：兔股骨髁软骨缺损处植入已胶凝化的,含0.5μg/ml SDF-1的PLGA-PEG-PLGA水凝胶,不加IGF-1PLGA微球；hydrogel+MS+SDF-1组：兔股骨髁软骨缺损处植入已胶凝化的,含10mg/ml IGF-1PLGA微球和0.5μg/ml SDF-1的PLGA-PEG-PLGA水凝胶；hydrogel+MS+SDF-1+ADSCs组：兔股骨髁软骨缺损处植入已胶凝化的,含10mg/ml IGF-1PLGA微球,0.5μg/ml SDF-1及1×106/ml ADSCs的PLGA-PEG-PLGA水凝胶。分别于术后第6周和第12周收集标本,分别对其进行进行形态学观察及评分,组织学观察及评分,Collagen Ⅰ, Collagen Ⅱ和Aggrecan的免疫组化染色,及实时定量PCR检测各组标本中SOX-9. Collagen Ⅰ、Collagen Ⅱ、Collagen Ⅹ和Aggrecan基因表达情况。结果在术后第6周和第12周,单独应用搭载了双生长因子的水凝胶复合体或同时结合ADSCs:进行软骨缺损修复的ICRS评分和MODS评分都明显优于另外三组。免疫组化染色结果显示此两组修复效果显著。实时定量PCR结果显示此两组对标本中SOX-9、Collagen Ⅱ和Aggrecan、基因表达的促进作用十分明显。结论PLGA-PEG-PLGA温敏型水凝胶在植入体内后能原位胶化定点持续缓释生长因子,并能为ADSCs提供适合其生长和分化的微环境,以其为载体搭载ADSCs、 SDF-1和IGF-1PLGA缓释微球的水凝胶复合体能有效的促进软骨组织再生,非常适合用于软骨组织工程研究,在软骨修复的临床研究中也应该有很大的应用前景。