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目的:通过内因湿热法建立慢性胃炎脾胃湿热证动物模型,观察湿热中阻方对脾胃湿热证小鼠的辅助性T淋巴细胞1(Th1)分泌的γ-干扰素(IFN-γ)和辅助性T淋巴细胞2(Th2)分泌的白细胞介素-4(IL-4),B淋巴瘤细胞-2基因(Bcl-2)和抑癌基因(p53)蛋白表达的调节作用,探讨湿热中阻方对脾胃湿热证小鼠炎症因子和免疫功能的影响。
方法:将80只SPF级昆明小鼠,雌雄各半随机分成6组,用于造模;将20只SP F级昆明小鼠,雌雄各半,作为正常组。造模组采用内因湿热法即高脂高糖饮食(使用白酒10mL/(Kg·d)、油脂10g/(Kg·d)隔日交替进行灌胃,蜂蜜水自由饮用)复制脾胃湿热证动物模型。然后将造模成功的小鼠随机编号分组,即模型组,黄芩滑石汤组,湿热中阻方低、中、高剂量组(6.2,12.4,24.8g/Kg),每组10只;从正常组中随机选取10只小鼠作为对照组。造模成功的小鼠进行连续14天的灌胃给药,并且恢复正常饮食,对照组和模型组给予相同剂量的生理盐水灌胃。两周后,经过末次给药后,禁食不禁水16h,眼球取血后脱颈处死,取胃组织,一半置于4%多聚甲醛溶液中固定24h以上,脱水,浸蜡,包埋,3μm切片,HE染色;另一半置于液氮中冷冻保存,做WB实验。用ELISA法检测IFN-γ、IL-4的含量;用HE染色法观察胃组织形态学的变化;用蛋白质印迹法检测Bcl-2、p53的蛋白表达水平。
结果:①对照组:体重逐渐增加,反应灵敏,进食量和饮水量正常,大便成形,毛发光亮。模型组:体重减轻,精神萎靡,反应迟钝,毛发干枯无光泽,大便溏稀,进食量和饮水量减少,肛温较对照组高。湿热中阻方和黄芩滑石汤组:灌胃一周后小鼠进食量和饮水量逐渐增加,精神状态好转,反应较之前灵敏,体重较之前增加,毛发的光泽度增加,肛温下降。其中以湿热中阻方高剂量组的症状改善最为明显。
②模型组小鼠血清IL-4和IFN-γ值明显高于对照组,湿热中阻方高、中剂量组IL-4和IFN-γ值明显低于模型组。
③小鼠胃黏膜病理组织切片结果显示,对照组小鼠胃黏膜层上皮细胞结构完整,胃小凹结构清晰,上皮细胞排列紧密;固有层胃腺丰富,主细胞、壁细胞形态结构正常,未见明显炎症。与对照组比较,模型组胃黏膜层可见上皮细胞脱落;固有层局部可见胃腺减少,结缔组织增生;黏膜下层可见水肿,结缔组织排列疏松;固有层与黏膜下层可见少量淋巴细胞与中性粒细胞浸润。与模型组比较,阳性药组固有层胃腺丰富,主细胞、壁细胞形态结构正常,黏膜下层可见水肿,结缔组织排列疏松,并伴有少量淋巴细胞浸润。湿热中阻方低、中、高剂量组随药物浓度增加,黏膜层上皮细胞脱落明显减少,固有层与黏膜下层淋巴细胞与中性粒细胞浸润明显减轻。湿热中阻方高剂量组仅黏膜层局部可见少量上皮细胞脱落,固有层胃腺丰富,主细胞、壁细胞形态结构正常,未见明显炎症,胃黏膜恢复最为明显。
④与对照组比较,模型组小鼠胃组织Bcl-2和p53的蛋白表达水平明显升高;与模型组比较,湿热中阻方低、中、高剂量组Bcl-2和p53的蛋白表达明显降低。
结论:①以辛开苦降为法则的自拟方湿热中阻方通过抑制炎症因子IL-4和IFN-γ的产生,减少炎症性渗出,促进炎症的吸收,从而减少过度免疫应答引起的组织损伤。
②以辛开苦降为法则的自拟方湿热中阻方可以抑制Bcl-2和p53蛋白的表达,促进损伤细胞凋亡,减少致癌因子的表达,可能具有预防细胞癌变和修复胃黏膜损伤的作用。
③以辛开苦降为法则的自拟方湿热中阻方成分较为复杂,对其药理作用还需要进一步深入研究,但由于实验条件和实验经费的限制,本实验只对其具有减少慢性胃炎脾胃湿热证的细胞炎症损伤和凋亡的作用机理进行初步的探讨,固有不足之处仍需进一步改进和完善。
方法:将80只SPF级昆明小鼠,雌雄各半随机分成6组,用于造模;将20只SP F级昆明小鼠,雌雄各半,作为正常组。造模组采用内因湿热法即高脂高糖饮食(使用白酒10mL/(Kg·d)、油脂10g/(Kg·d)隔日交替进行灌胃,蜂蜜水自由饮用)复制脾胃湿热证动物模型。然后将造模成功的小鼠随机编号分组,即模型组,黄芩滑石汤组,湿热中阻方低、中、高剂量组(6.2,12.4,24.8g/Kg),每组10只;从正常组中随机选取10只小鼠作为对照组。造模成功的小鼠进行连续14天的灌胃给药,并且恢复正常饮食,对照组和模型组给予相同剂量的生理盐水灌胃。两周后,经过末次给药后,禁食不禁水16h,眼球取血后脱颈处死,取胃组织,一半置于4%多聚甲醛溶液中固定24h以上,脱水,浸蜡,包埋,3μm切片,HE染色;另一半置于液氮中冷冻保存,做WB实验。用ELISA法检测IFN-γ、IL-4的含量;用HE染色法观察胃组织形态学的变化;用蛋白质印迹法检测Bcl-2、p53的蛋白表达水平。
结果:①对照组:体重逐渐增加,反应灵敏,进食量和饮水量正常,大便成形,毛发光亮。模型组:体重减轻,精神萎靡,反应迟钝,毛发干枯无光泽,大便溏稀,进食量和饮水量减少,肛温较对照组高。湿热中阻方和黄芩滑石汤组:灌胃一周后小鼠进食量和饮水量逐渐增加,精神状态好转,反应较之前灵敏,体重较之前增加,毛发的光泽度增加,肛温下降。其中以湿热中阻方高剂量组的症状改善最为明显。
②模型组小鼠血清IL-4和IFN-γ值明显高于对照组,湿热中阻方高、中剂量组IL-4和IFN-γ值明显低于模型组。
③小鼠胃黏膜病理组织切片结果显示,对照组小鼠胃黏膜层上皮细胞结构完整,胃小凹结构清晰,上皮细胞排列紧密;固有层胃腺丰富,主细胞、壁细胞形态结构正常,未见明显炎症。与对照组比较,模型组胃黏膜层可见上皮细胞脱落;固有层局部可见胃腺减少,结缔组织增生;黏膜下层可见水肿,结缔组织排列疏松;固有层与黏膜下层可见少量淋巴细胞与中性粒细胞浸润。与模型组比较,阳性药组固有层胃腺丰富,主细胞、壁细胞形态结构正常,黏膜下层可见水肿,结缔组织排列疏松,并伴有少量淋巴细胞浸润。湿热中阻方低、中、高剂量组随药物浓度增加,黏膜层上皮细胞脱落明显减少,固有层与黏膜下层淋巴细胞与中性粒细胞浸润明显减轻。湿热中阻方高剂量组仅黏膜层局部可见少量上皮细胞脱落,固有层胃腺丰富,主细胞、壁细胞形态结构正常,未见明显炎症,胃黏膜恢复最为明显。
④与对照组比较,模型组小鼠胃组织Bcl-2和p53的蛋白表达水平明显升高;与模型组比较,湿热中阻方低、中、高剂量组Bcl-2和p53的蛋白表达明显降低。
结论:①以辛开苦降为法则的自拟方湿热中阻方通过抑制炎症因子IL-4和IFN-γ的产生,减少炎症性渗出,促进炎症的吸收,从而减少过度免疫应答引起的组织损伤。
②以辛开苦降为法则的自拟方湿热中阻方可以抑制Bcl-2和p53蛋白的表达,促进损伤细胞凋亡,减少致癌因子的表达,可能具有预防细胞癌变和修复胃黏膜损伤的作用。
③以辛开苦降为法则的自拟方湿热中阻方成分较为复杂,对其药理作用还需要进一步深入研究,但由于实验条件和实验经费的限制,本实验只对其具有减少慢性胃炎脾胃湿热证的细胞炎症损伤和凋亡的作用机理进行初步的探讨,固有不足之处仍需进一步改进和完善。