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着丝粒作为真核生物染色体的重要结构之一,是有丝分裂和减数分裂过程中重要的功能元件,其重要作用越来越受到人们的重视。在细胞有丝分裂和减数分裂中,着丝粒参与了同源染色体配对、充当姐妹染色单体黏合位点、介导分离及分裂后期启动调控等,保证染色体正常分离到子细胞。由于着丝粒对细胞生命活动不可或缺的重要功能,其序列、结构及相关蛋白的研究成为了热点。着丝粒区域高度异染色质化且富含大量的重复序列和反转录转座子,对该区域基因组数据的拼接造成了巨大的障碍,这个特点也加大了研究者获取其序列的难度。随着分子技术和测序技术的发展,越来越多的物种的着丝粒重复序列得到解析。研究者发现,与其功能的绝对保守性相悖,着丝粒区域的DNA序列在不同物种中的长度和碱基组成上相差较大,呈现快速趋异进化的趋势。这一有趣的现象被称为“着丝粒悖论”。在着丝粒区域也普遍存在少量活性基因,推测其转录过程对于着丝粒区域的表观修饰起重要作用。与着丝粒重复序列不同,着丝粒特异组蛋白CENH3序列在不同物种间具有60%左右的相似性。CENH3蛋白对于着丝粒功能的重要性已被许多文献报道,它不仅充当着丝粒结构的基本骨架,还能在分裂过程中介导动粒蛋白复合体的组装。CENH3蛋白C端含有高度保守的HFD结构域,其N端却较为多变,推测是为了适应着丝粒序列的快速进化。已有研究指出,着丝粒功能的行使必须依靠CENH3蛋白,而着丝粒重复序列则不是必需的,CENH3蛋白可作为活性着丝粒的分子标记。由于CENH3蛋白能够与着丝粒序列直接结合的特性,近年来研究者广泛利用CENH3蛋白来获取着丝粒重复序列。川桑(Morus notabilis)基因组测序已于2013年完成,但其着丝粒区域序列仍然未知,而关于川桑的CENH3蛋白的研究也未开展。本研究利用生物信息学方法,从川桑全基因组数据库中首次鉴定了到了两个MnCenH3基因,MnCenH3-1和MnCenH3-2。同时鉴定得到编码川桑组蛋白的H3.2和H3.3基因,经多序列比对,川桑H3.2和H3.3基因序列与拟南芥中的完全一致,表明H3组蛋白在真核生物中极度保守。MnCenH3-1基因共编码199个氨基酸,而MnCenH3-2基因共编码129个氨基酸。经蛋白序列比对发现,MnCENH3-2全长与MnCENH3-1 C端序列几乎完全相同,仅有4个氨基酸的差异。进一步基因结构分析表明,MnCenH3-1共包含7个外显子,MnCenH3-2相较于MnCenH3-1来说,缺失了第1和第2个外显子,并从第二个内含子末端起始翻译,推断MnCenH3-1为全长基因,MnCenH3-2则是一个截短型的可变剪切体。MnCENH3-1在N端有一段21个氨基酸的内部重复序列,造成了MnCENH3-1长于其他同源蛋白。MnCENH3-1与MnCENH3-2均具有典型的CENH3蛋白结构:N端序列差异较大,C端序列高度保守,具有4个α螺旋及两个环状结构以及与着丝粒重复序列直接结合的CATD区。通过MnCENH3序列构建系统发生树,结果表明川桑与蔷薇科植物聚在同一大枝,说明其在进化过程中关系较近。构建MnCENH3基因的表达载体并成功纯化得到MnCENH3蛋白。利用其纯化蛋白进行DNA免疫共沉淀实验(DIP),对富集的川桑DNA片段进行非特异性扩增,经回收测序却未能得到着丝粒区域序列,经多次改进实验体系重复后均未能得到较为理想结果,推测可能是原核表达蛋白未经过正确折叠修饰而导致表达的融合蛋白无活性,亦或是蛋白标签与亲和介质结合力度不够,DIP实验体系不稳定等复杂原因造成。后续研究可以通过改用真核表达体系,换用蛋白标签与亲和介质,优化DIP实验条件来改善。本研究还以MnCENH3蛋白N端11个氨基酸的肽段作为抗原,制备了Anti-MnCENH3多克隆抗体,利用蛋白免疫荧光技术对川桑的着丝粒进行追踪,但只在阳性对照组中检测到信号,在实验组中点状,中长型和较长型中期染色体上均未能观测到着丝粒荧光信号。可能是由于抗体质量未满足实验需求,玻片上抗原序列未能暴露等原因造成,后续研究可以更换抗体来进行改善。本研究首次对川桑的MnCenH3基因进行了鉴定,制备了川桑特异着丝粒蛋白MnCENH3抗体,并对川桑着丝粒序列进行了初步的探索,虽未取得较为理想结果,但为往后的川桑着丝粒序列和相关蛋白研究提供了实验基础以及后续研究展望。