【摘 要】
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丝膜菌（Cortinarius sp.）是一种珍贵的野生真菌资源,其次生代谢产物结构多样,具有丰富的生物活性,如抗肿瘤活性、抗氧化活性、抗菌活性和抗虫活性等,极具研究价值。其中含量最多的化合物为聚酮类化合物,是丝膜菌中活性物质的主要来源。本文主要选择谷胱甘肽S-转移酶（glutathione S-transferase,GST）和谷氨酸脱氢酶（glutamate dehydrogenase,GDH
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丝膜菌（Cortinarius sp.）是一种珍贵的野生真菌资源,其次生代谢产物结构多样,具有丰富的生物活性,如抗肿瘤活性、抗氧化活性、抗菌活性和抗虫活性等,极具研究价值。其中含量最多的化合物为聚酮类化合物,是丝膜菌中活性物质的主要来源。本文主要选择谷胱甘肽S-转移酶（glutathione S-transferase,GST）和谷氨酸脱氢酶（glutamate dehydrogenase,GDH）作为靶点,研究丝膜菌中聚酮类化合物在抗虫和抗肿瘤方面的应用。其中GST为昆虫解毒酶,它能够保护昆虫不受杀虫剂毒害;GDH活性的降低可能起到抗虫效果,同时它能够抑制肿瘤的生长。本研究从长白山采摘的丝膜菌中通过浸泡提取法和超声提取法提取得到乙醇粗提物,再通过石油醚、乙酸乙酯、正丁醇进行萃取,得到三个萃取相和一个萃余水相。通过酶促反应动力学实验方法,测定4个萃取部分对GST和GDH的抑制作用,确认其乙酸乙酯相对GST和GDH的抑制效果最强。通过硅胶柱、凝胶柱、反相柱色谱法并结合TLC薄层色谱法从乙酸乙酯相中分离纯化得到三种聚酮类化合物,并通过核磁共振技术(~1H-NMR、13C-NMR、HSQC、HMBC、~1H-~1HCOSY、NOESY)、质谱、圆二色谱（CD）等波谱技术进行结构鉴定,最终确认其结构,分别为:rufoolivacin E（1）、viocristin B（2）、1-Hydroxy-3,6,8-trimethoxyanthraquinone（3）。其中1为新的聚酮类化合物,2、3是首次分离得到的天然产物。将本文从丝膜菌属乙酸乙酯相中分离得到的3种化合物以及实验室前期获得的13种丝膜菌属中的存在的化合物:大黄素（emodin,4）、大黄素1-甲醚（1-O-methylemodin,5）、Ω-羟基大黄素-8-甲醚（questinol,6）、rufoolivacin A（7）、rufoolivacin C（8）、穗花衫双黄酮（endothianin,9）、cassiamin B（10）、anhydrophlegmacin-9,10-quinone-8’-O-meth-yl ether（11）、sinapiquinone（12）、2,2’’-birufoolivacin B（13）、虫漆酸D（laccaic acid D,14）、山扁豆酸（endocrocin,15）、SEK 15b（16）,共16种聚酮类化合物,通过酶促反应动力学实验探究其对GST与GDH的抑制作用。16种聚酮类化合物中有4种化合物对GST有抑制作用,抑制效果:11＞16＞1＞15。同时,对GDH有抑制作用的化合物有8种,其中4与9有极强的抑制作用,通过拟合米氏方程双倒数曲线对4、9抑制剂类型进行分析,确定这两种化合物都为GDH竞争性抑制剂,4的Ki为2.09±0.73μM,9的Ki为5.39±1.99μM。其他6个化合物对GDH有一定的抑制作用,抑制效果:1＞8＞11＞5＞15＞10。再结合分子对接技术模拟化合物与GST、GDH的结合,推测其结合位点,辅助酶促反应动力学手段阐释其作用机理。综上所述,本文从丝膜菌中分离得到了三种化合物,其中一种是首次发现的聚酮类化合物以及两种首次分离得到的天然产物,筛选出了4种对GST具有抑制作用的化合物,同时发现了2种活性较好的GDH竞争性抑制剂。本文针对GST和GDH抑制剂及其抑制机理的研究,证明了聚酮类化合物在害虫防治上的应用前景以及开发成抗肿瘤药物的潜力,为天然产物在害虫防治及医药领域提供了新的思路。
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