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手足口病（hand,foot,and mouth disease,HFMD）是一种由病毒感染引起的传染病,其中肠道病毒71型（enterovirus 71,EV71）及柯萨奇病毒A16 型（coxsackievirus A16,CVA16）是 HFMD 的主要病原体。天然免疫是宿主抵御入侵病原体感染的第一道防线。Toll样受体（toll-like receptors,TLRs）是一大类重要的模式识别受体（pattern-recognition receptors,PRRs）,目前已知的 TLRs 主要包括定位在宿主细胞膜上的TLRs（TLR1、TLR2、TLR4、TLR5、TLR6）和定位在宿主细胞内体上的TLRs（TLR3、TLR7、TLR8、TLR9）。课题组前期研究表明转染膜型TLR2单体及TLR2异源二聚体（TLR2/TLR1、TLR2/TLR6）后,EV71 致 HEK293 细胞的 CPE 明显被抑制且EV71的复制水平下降;,但TLR2募集TLR1和TLR6抗EV71感染的分子机制仍不清楚;另外膜型TLR单体（TLR1、TLR2、TLR6）是否具有抗EV71的潜力,目前也是未知,需要开展进一步的深入研究。为此,本文围绕上述两个关键科学问题开展如下研究:第一部分:EV71经膜型TLR单体和TLR2异源二聚体启动天然免疫应答目的:探索人源/鼠源膜型TLR单体（TLR2、TLR1、TLR6）和TLR2异源二聚体（TLR2/TLR1、TLR2/TLR6）抑制EV71复制的能力、活化天然免疫应答途径和细胞因子反应的分子机制。方法:将人源或鼠源膜型TLR单体（TLR2、TLR1、TLR6）和TLR2异源二聚体（TLR2/TLR1、TLR2/TLR6）转染至 HEK293 细胞,EV71 感染24h后,收集细胞上清、提取病毒核酸、实时荧光定量RT-PCR检测EV71基因组拷贝数;酶联免疫吸附实验检测细胞上清液中细胞因子IL-8的生成水平;RIPA裂解液裂解细胞并收集总蛋白,免疫印迹实验检测PI3K调节亚基p85、AKT磷酸化水平、MAPKs（p38、JNK和ERK）的磷酸化水平。结果:1.与EV71感染未转染HEK293细胞相比,,转染人源或鼠源膜型TLR单体（TLR2、TLR1、TLR6）后EV71基因组拷贝数显著下降;转染人源或鼠源TLR2异源二聚体（TLR2/TLR1、TLR2/TLR6）和转染人源TLR2/CD14异源二聚体后,EV71基因组拷贝数也显著下降且呈现转染剂量依赖性。2.与EV71感染未转染HEK293细胞相比,EV71能够经人源或鼠源膜型TLR单体（TLR2、TLR1、TLR6）、人源或鼠源TLR2异源二聚体（TLR2/TLR1、TLR2/TLR6）和人源 TLR2/CD14 异源二聚体介导 IL-8的生成且呈现转染剂量依赖性。3.与正常HEK293细胞相比,EV71能够经人源或鼠源膜型TLR单体（TLR2、TLR1、TLR6）,人源或鼠源 TLR2 异源二聚体（TLR2/TLR1、TLR2/TLR6）和人源TLR2/CD14异源二聚体上调PI3K调节亚基p85的表达并引起其下游分子AKT发生磷酸化,最终使PI3K/AKT途径活化;同时MAPK途径（ERK、JNK和p38）也都发生不同程度的磷酸化。第二部分:EV71经条件改变TLR2异源二聚体启动天然免疫应答目的:为了进一步验证TLR2异源二聚体（TLR2/TLR1、TLR2/TLR6）抗EV71感染及其活化天然免疫应答机制,该部分通过条件改变型TLR2异源二聚体进一步探讨其抗EV71感染的天然免疫应答分子机制。方法:将人/鼠杂交型TLR2异源二聚体（TLR2/mTLR6、TLR2/mTLR1、mTLR2/TLR6、mTLR2/TLR1）或功能缺失型TLR2异源二聚体（DN-TLR2/TLR1、TLR2/DN-TLR1、DN-TLR2/TLR6、TLR2/DN-TLR6）转染至HEK293细胞,实验方法同第一部分。结果:1.与EV71感染的未转染HEK293细胞相比,转染人/鼠杂交TLR2异源二聚体（TLR2/mTLR6、TLR2/mTLR1、mTLR2/TLR6、mTLR2/TLR1）及功能缺失型 TLR2 异源二聚体（DN-TLR2/TLR1、TLR2/DN-TLR1、DN-TLR2/TLR6、TLR2/DN-TLR6）的 HEK293 细胞中 EV71 基因组拷贝数显著下降。2.与EV71感染的未转染HEK293细胞相比,EV71能够活化转染人/鼠杂交型 TLR2 异源二聚体（TLR2/mTLR6、TLR2/mTLR1、mTLR2/TLR6、mTLR2/TLR1）的 HEK293 细胞的 IL-8 生成,但是功能缺失型 TLR2 异源二聚体（DN-TLR2/TLR1、TLR2/DN-TLR1、DN-TLR2/TLR6、TLR2/DN-TLR6）不能介导 IL-8 的生成。3.与正常HEK293细胞相比,EV71能够活化转染人/鼠杂交型TLR2异源二聚体（TLR2/mTLR6、TLR2/mTLR1、mTLR2/TLR6、mTLR2/TLR1）或功能缺失型 TLR2 异源二聚体（DN-TLR2/TLR1、TLR2/DN-TLR1）的HEK293细胞的PI3K/AKT途径和MAPK途径。第三部分:EV71衣壳蛋白经膜型TLR2单体和TLR2异源二聚体活化天然免疫应答目的:进一步探索EV71衣壳蛋白能否经膜型TLR2单体和TLR2异源二聚体（TLR2/TLR1、TLR2/TLR6）活化宿主细胞抗EV71天然免疫应答的分子机制。方法:将EV71衣壳蛋白（VP1、VP2、VP3、VP4）基因克隆至原核表达载体 pGEX-4T-1 上,构建 EV71 衣壳蛋白（VP1、VP2、VP3、VP4）的原核重组表达质粒并进行重组EV71衣壳蛋白（VP1、VP2、VP3、VP4）大量表达和重组蛋白纯化;重组EV71衣壳蛋白（VP1、VP2、VP3、VP4）刺激转染膜型TLR2单体和TLR2异源二聚体（TLR2/TLR1、TLR2/TLR6）的HEK293细胞、人扁桃体上皮细胞UT-SCC-60B;构建EV71衣壳蛋白（VP1、VP2、VP3、VP4）的真核重组表达质粒,单独转染或与TLR2单体和TLR2异源二聚体（TLR2/TLR1、TLR2/TLR 6）共转染至人扁桃体上皮细胞UT-SCC-60B;收集细胞上清和细胞总蛋白,检测IL-6和IL-8的生成水平,确定PI3K/AKT途径和MAPK途径的活化,确定膜型TLR2、TLR1、TLR6的表达变化。结果:1.与正常HEK293细胞相比,重组纯化的EV71衣壳蛋白（VP1、VP2、VP3、VP4）能够经膜型TLR2单体和TLR2异源二聚体（TLR2/TLR1、TLR2/TLR6）介导IL-8的生成并活化PI3K/AKT途径和MAPK途径;只有重组纯化的EV71衣壳蛋白（VP2、VP3、VP4）能够上调人扁桃体上皮细胞UT-SCC-60B的IL-6生成,只有重组纯化的EV71衣壳蛋白（VP1和VP3）能够上调人扁桃体上皮细胞UT-SCC-60B的IL-8生成;重组纯化的EV71衣壳蛋白（VP1、VP2、VP3、VP4）能够不同程度的活化PI3K/AKT途径和MAPK途径并调控膜型TLR2、TLR1、TLR6的表达水平。2.与正常人扁桃体上皮细胞UT-SCC-60B相比,转染真核重组EV71衣壳蛋白（VP1、VP2、VP3、VP4）质粒后,人扁桃体上皮细胞UT-SCC-60B的IL-6和IL-8的生成水平显著发生上调;同时能够不同程度的活化PI3K/AKT途径和MAPK途径并调控膜型TLR2、TLR1、TLR6的表达水平。结论:1.膜型 TLR2、TLR1、TLR6 单体及 TLR2/TLR1、TLR2/TLR6、TLR2/CD14异源二聚体能够抑制EV71复制;2.EV71 经膜型 TLR2、TLR1、TLR6 单体及 TLR2/TLR1、TLR2/TLR6、TLR2/CD14异源二聚体活化宿主细胞的细胞因子反应;3.EV71 经膜型 TLR2、TLR1、TLR6 单体及 TLR2/TLR1、TLR2/TLR6、TLR2/CD14异源二聚体能够活化PI3K/AKT途径和MAPK途径;4.EV71衣壳蛋白能够通过经TLR2单体及TLR2/TLR1、TLR2/TLR6异源二聚体活化PI3K/AKT途径和MAPK途径并产生细胞因子反应。