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研究目的:胶质母细胞瘤（Glioblastoma,GBM）作为侵袭性和致命性最强的原发性脑肿瘤,其主要特征就在于其恶性生长、侵入脑实质和化疗抵抗。同时,GBM也是一种表现为高度的肿瘤间和肿瘤内异质性的疾病。尽管包括手术切除、放疗和化疗在内的综合疗法有所改进,以及免疫疗法、电场疗法等新秀的加入,但是到目前为止,胶质瘤患者的预后仍然不容乐观。因此目前针对致病基因及相关信号通路的靶向疗法就成为治疗胶质瘤的重要手段之一。一直以来,PI3K/AKT/mTOR信号通路在GBM中调控多种细胞过程,如肿瘤细胞的增殖、分化、存活、细胞转化和转移等。GNE-477作为PI3K/mTOR信号靶点的新型双重抑制剂,目前尚未报道过其对GBM是否具有抗肿瘤作用。本研究的目的是探讨GNE-477对GBM细胞恶性增殖的影响,并阐明其可能的作用机制,为GBM靶向疗法的新药研究和临床转化提供一定的研究基础。研究方法:1.不同浓度的GNE-477处理U87和U251细胞24 h或者48 h后,对于GNE-477对胶质瘤细胞系细胞增殖的影响采用Cell Counting Kit-8（CCK-8）来检测吸光度值（OD值）的变化、EdU实验来检测细胞DNA合成情况;流式细胞学实验检测各组细胞中DNA合成前期、合成期以及合成后期的具体分布情况;通过Western Blot和免疫荧光实验来检测细胞周期蛋白Cyclin D1的表达。2.通过划痕实验、Transwell侵袭实验检测GNE-477对GBM细胞迁移和侵袭能力的影响。Western Blot用来检测MMP2的表达。3.膜联蛋白PE/7-AAD染色结合流式细胞学分析用来检测GNE-477对U87和U251细胞的凋亡影响。JC-1染色用来检测两种细胞中线粒体膜电位（ΔΨm）的变化。Western Blot用来检测凋亡相关蛋白Bax、Bad和Bcl-2的表达情况。4.通过Western blot检测不同浓度GNE-477对胶质瘤细胞中AKT、P-AKT、mTOR、P-mTOR的蛋白表达情况。接着,用AKT信号通路激活剂SC79对胶质母细胞瘤细胞进行预处理,结合CCK-8、EdU和Western blot等实验来研究SC79对GNE-477调控胶质母细胞瘤恶性进展相关实验的逆转现象。5.用稳定表达荧光素酶的胶质瘤U87-MG细胞株来建立裸鼠颅内移植瘤模型,并通过尾静脉间断注射抑制剂或对照媒介的方式,研究GNE-477对胶质瘤生长的体内影响。通过活体动物生物发光成像系统评估肿瘤生长,苏木精和伊红（H＆E）染色用来展示肿瘤大小,Western blot和免疫组织化学染色用来检测药物处理组和Control组之间的主要蛋白的表达情况。研究结果:1.CCK-8实验结果表明,GNE-477明显抑制了U87和U251细胞的生长,且表现出时间依赖性和剂量依赖性。而且GNE-477处理后的U87和U251细胞中的DNA复制水平相对于对照组而言远远较低。通过流式细胞学分析细胞周期,GNE-477显著抑制了胶质瘤细胞的增殖,诱导了G1期的阻滞。Western blot和免疫荧光检测得出,GNE-477显著抑制了胶质瘤细胞中Cyclin D1的表达。2.细胞划痕实验以及Transwell侵袭实验表明,GNE-477处理后显著抑制了U87和U251细胞的迁移和侵袭能力,同时Western blot的结果表明GNE-477以浓度依赖性的方式显著降低了MMP2的表达。3.流式细胞学实验结果显示,GNE-477以浓度依赖性的方式明显诱导了胶质瘤细胞的凋亡。JC-1染色显示,相比于非处理组,GNE-477使细胞中反映线粒体膜电位的红蓝荧光比值大大降低。Western blot实验发现GNE-477处理胶质瘤细胞后,上调了细胞中Bax、Bad的蛋白表达,而下调了细胞中Bcl-2的蛋白表达。4.首先Western blot实验结果发现,不同浓度（0μM、0.5μM、2μM和8μM）的GNE-477预处理U87和U251细胞系后,GNE-477以浓度依赖性的方式抑制了细胞内P-AKT和P-mTOR的表达而总的AKT和mTOR的蛋白表达基本保持不变。在挽救实验中发现,加入SC79处理后可以显著增加细胞内p-AKT和P-mTOR的蛋白含量,同时也明显削弱了GNE-477对GBM细胞增殖的影响。5.在体内实验中,通过活体生物发光成像检测发现GNE-477明显抑制了裸鼠中的胶质瘤生长,HE染色结果也表明了GNE-477治疗组的裸鼠中胶质瘤体积显著小于对照组。Western blot实验表明,GNE-477降低了肿瘤组织中Bcl-2、P-AKT、P-mTOR、Cyclin D1的蛋白表达,而促进了Bax、Bad的蛋白表达。进一步的免疫组织化学染色结果也表明了,GNE-477显著抑制了肿瘤组织中P-AKT、p-mTOR、Bcl-2的蛋白表达,而促进了Bax的蛋白表达。研究结论:1.GNE-477可以抑制胶质母细胞瘤细胞增殖、诱导细胞周期停滞和促进细胞凋亡,同时也可以延缓细胞迁移和侵袭。2.GNE-477可以穿透血脑屏障从而抑制小鼠的颅内胶质瘤的生长。3.GNE-477的抑癌作用是通过调控AKT/mTOR信号通路来实现的。