咖啡因是一种黄嘌呤生物碱化合物,除了常见的茶叶和咖啡,人们还在许多其他的植物中都发现了它的存在。作为一种中枢神经兴奋剂,咖啡因通过饮料的方式少量使用时能够帮助人们暂时驱走睡意保持清醒,因此成为世界上使用最为普遍的精神类药物。但并不是所有人都可以享受到咖啡因带来的精神愉悦,部分人群使用后会出现心跳加快、肌肉震颤、多汗、失眠、焦虑和肠胃功能紊乱等副反应。近期的研究发现咖啡因的代谢产物1,3,7,9-三甲基尿酸(theacrine)虽然与咖啡因结构相似,但却没有显著的中枢神经兴奋作用,相反它具有抗抑郁、提高记忆和学习能力和防止非酒精性脂肪肝病等功效。目前在茶叶和咖啡中,咖啡因的生物合成途径已经被阐明清楚,即由黄嘌呤核苷经7-甲基化生成7-甲基黄嘌呤核苷,再脱去5-位的核糖并异构化生成7-甲基黄嘌呤,接下来发生3-位甲基化生成可可碱,进一步1-位甲基化生成咖啡因。与咖啡因相比,theacrine在8位的碳上多了一个羰基氧,在9位的N上多了一个甲基。但咖啡因是如何生成theacrine的还有待深入研究。我们的合作者暨南大学药学院何蓉蓉团队从一种稀有的苦茶(Kucha)中克隆得到了三个N-甲基转移酶:Ck CS、Ck Tb S和Ck Tc S。体外酶活试验证实Ck Tc S具有奇特的N9-甲基转移酶活性,它可以将1,3,7-三甲基尿酸的N9位进行甲基化生成theacrine。Ck Tc S与Ck CS、Ck Tb S序列高度保守,催化活性却明显不同。为了阐述Ck Tc S的N9-甲基化活性的分子机制,本课题开展了对Ck Tc S和Ck Tb S的结构机制研究。通过高通量的筛选,我们成功的获得了apo状态下的Ck Tb S和Ck Tc S-SAH-1,3,7-三甲基尿酸的三元复合物晶体,并解析了其晶体结构。与已经深入研究的咖啡的N-甲基转移酶结构相比较发现,它们的整体构象高度相似,都是由N-端灵活的Capping结构域和C端的催化结构域组成,并且由两个单体蛋白形成同源二聚体来发生功能。在Ck Tc S-SAH-1,3,7-三甲基尿酸的三元复合物晶体结构中,组成1,3,7-三甲基尿酸结合口袋的残基包括Capping结构域的Met-15,Tyr-24,及催化结构域中的Phe-30、Thr-31、Tyr-157、His-160、Trp-161、Arg-226、Ile-241、Trp-242、Cys-270、Ile-318与Phe-322。这其中Tyr-24、Thr-31、Arg-226、Trp-161和His-160与1,3,7-三甲基尿酸形成直接氢键相互作用,而Tyr-157和Phe-322通过π-π-stacking作用将1,3,7-三甲基尿酸夹在中间。值得注意的是,Thr-31与1,3,7-三甲基尿酸C-8位的羰基形成了氢键,从而可能诱导N-9,C-8和O-8形成烯醇式结构,从而促进N-9甲基化的发生。此外,为了探究Ck Tc S的底物特异性,我们叠加了Ck Tc S-SAH-1,3,7-三甲基尿酸结构与Ck Tb S的结构。虽然两者处于不同的状态,但参与底物识别的残基在两个结构中都几乎处于同样的构象,说明底物结合并不会导致结构口袋发生较大的构象变化。结合Ck Tc S,Ck Tb S核Ck CS的氨基酸序列对比,我们进一步确定了影响Ck Tc S底物特异性的关键氨基酸残基:Arg-226,Ile-241和Cys-270。体外酶活试验显示,将Ck Tb S上相应的这三个氨基酸单点突变、双突变和三突变,可以明显提高Ck Tb S的N-9甲基化活性,并且随着突变残基数量的增加,其催化活性也相应增加。最后,将茶叶与咖啡的N-甲基转移酶的活性中心进行对比,发现他们对底物的识别方式也符合趋同进化的模式,支持了以前通过基因组测序得出的结论。综上所诉,本课题对茶叶的N-甲基转移酶的结构进行了研究,阐述了一个新颖的N9-甲基转移酶底物识别机制,不仅加深了我们对N-甲基转移酶家族的认识,也为开发含theacrine的低咖啡因饮料指出了一个新的方向。