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施万细胞是参与周围神经髓鞘形成的唯一细胞,施万细胞包绕轴突形成的具有板层结构的髓鞘,这种结构具有保护轴突、传导动作电位以及物质运输等重要作用。髓鞘发育不良引起感觉及运动功能障碍。施万细胞具有高度可塑性,在髓鞘发育阶段,施万细胞经历增殖、迁移和分化等过程。周围神经损伤后,失神经支配的远端发生华勒变性,伴随轴突和髓鞘的崩解,施万细胞转变为去分化状态,也称为“修复型”细胞,辅助巨噬细胞清除组织碎片,重新获得增殖和再分化的能力。基于这一特性,相较于中枢神经,周围神经表现出更强的再生能力。施万细胞的分化和去分化有许多转录因子参与,如分化需要Krox20和Sox10等转录因子的表达;去分化需要c-Jun、Sox2和NF-κB等转录因子的表达。SIRT6,属于烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）依赖的一种蛋白脱乙酰酶,它在延缓衰老、促进DNA修复、维持能量代谢、抑制炎症、调控脂质代谢等过程中发挥重要作用。周围神经髓鞘发育是以由转录因子精密调控的施万细胞分化和富含胆固醇的细胞膜合成为前提的,研究表明,SIRT6作为转录辅因子直接或间接调控转录因子表达或活化,此外SIRT6调控胆固醇合成。因此,我们推测SIRT6可能通过影响施万细胞胆固醇合成或调控转录因子表达从而影响施万细胞分化和去分化。目前,关于SIRT6在周围神经系统中的表达和作用未见报道。我们提出科学问题:它在周围神经发育阶段和损伤后是否表达、如何表达?以及其在髓鞘发育阶段施万细胞分化及神经损伤后施万细胞去分化中分别发挥何种作用,具体机制又是如何?研究目的:探究SIRT6在施万细胞分化和去分化中的作用和机制,以期望为周围神经髓鞘发育和神经再生提供新的理论依据。研究方法:1.分离出生后不同年龄C57BL/6小鼠的坐骨神经,利用Western blotting和组织切片免疫荧光技术检测SIRT6随坐骨神经发育的时空表达模式。以C57BL/6小鼠脊神经为原代施万细胞来源,加入dbcAMP和heregulin 1β诱导其获得分化表型,利用Western blotting和细胞免疫荧光染色检测SIRT6在分化施万细胞中的表达。从组织、细胞水平探明SIRT6在施万细胞分化中的表达。2.构建针对SIRT6 mRNA的shRNA慢病毒,对C57BL/6乳鼠坐骨神经进行显微注射以沉默体内施万细胞SIRT6表达,利用Western blotting和组织免疫荧光检测SIRT6、MAG和MBP表达,用透射电镜观察髓鞘结构,以探究SIRT6在髓鞘发育中的作用;在体外,用shRNA慢病毒转染或用SIRT6抑制剂OSS128167处理施万细胞再诱导其获得分化表型,利用Western blotting和细胞免疫荧光染色检测施万细胞幼稚标志物（p75和c-Jun）和成熟标志物（Krox20和MAG）的表达,探究抑制SIRT6对施万细胞分化的影响。3.探究SIRT6是否通过胆固醇合成途径影响施万细胞分化和髓鞘形成。检测胆固醇合成关键限速酶角鲨烯合酶（Squalene synthase,SQS或FDFT1）在施万细胞分化中的表达及SIRT6沉默对FDFT1表达及细胞胆固醇合成的影响。4.利用qPCR和Western blotting检测坐骨神经夹伤不同时间点SIRT6的表达变化,利用坐骨神经外植块培养这一体外华勒变性模型,在外植块培养中分别加入SIRT6抑制剂OSS128167、SIRT6激动剂UBCS039和JNK抑制剂SP600125,利用Western blotting和组织切片或神经单纤维免疫荧光染色检测NF、MBP、MAG和c-Jun的表达,以探究SIRT6活性变化对华勒变性和施万细胞去分化的影响;进一步在施万细胞体外去分化模型中加入OSS128167探究SIRT6对施万细胞去分化的影响;利用免疫沉淀鉴定SIRT6和c-Jun的互作关系,探究SIRT6是否以c-Jun为靶点调控损伤后华勒变性和施万细胞去分化。研究结果:1.SIRT6在P4坐骨神经中表达较低,P7-P14表达逐渐升高并于P14达到高峰,从P21-8W其表达逐渐降低,并在成熟坐骨神经中保持较低表达水平。SIRT6特异性表达于髓鞘而非轴突。在体外诱导分化的施万细胞中,SIRT6在分化施万细胞中表达显著上调。提示SIRT6可能参与施万细胞分化和髓鞘形成。2.shSIRT6慢病毒显微注射乳鼠坐骨神经显著降低体内施万细胞SIRT6蛋白水平,导致髓鞘变薄、减少髓鞘蛋白MAG和MBP表达;shSIRT6慢病毒转染或OSS128167处理显著抑制施万细胞分化。提示沉默SIRT6阻碍施万细胞分化和髓鞘形成。3.STRING蛋白互作网络显示SIRT6可能参与施万细胞胆固醇合成,SIRT6沉默抑制胆固醇合成的重要基因包括Hmgcr,Fdft1,Idi1和Lss表达,最终导致施万细胞内的游离胆固醇水平下降。4.SIRT6表达在周围神经损伤3 dpi-7 dpi期间逐渐上调,于7 dpi达到表达高峰,之后逐渐下降至较低水平。抑制SIRT6活性加快华勒变性进程（包括轴突、髓鞘退变和施万细胞去分化）;反之,增加SIRT6活性减慢上述过程。5.SIRT6直接靶向施万细胞去分化关键转录因子c-Jun,SIRT6沉默导致c-Jun表达升高,从而负向调节华勒变性。研究结论:1.SIRT6在施万细胞分化和髓鞘发育关键时期表达上调,沉默SIRT6抑制施万细胞分化,导致髓鞘发育不良,原因是抑制SIRT6的表达减少施万细胞胆固醇合成。2.SIRT6直接靶向转录因子c-Jun负向调控周围神经损伤后华勒变性进程,包括轴突、髓鞘退变以及施万细胞去分化。