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乳腺癌是全球女性癌症死亡的主要原因之一。尽管手术结合放疗、化疗和生物治疗方案取得了较好的治疗效果，但仍有近25％患者最终复发。其中一个原因是乳腺癌干细胞（BCSC）的存在，其显示出自我更新、多向分化和易使癌症远处转移与复发的特征。因此，靶向BCSC减少其亚群数量是有效治疗乳腺癌的关键。本课题组之前通过miRNA芯片研究发现，miR-7在BCSC中低表达，过表达miR-7降低了BCSC亚群并且部分逆转了人乳腺癌 MDA-MB-231 细胞的上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition, EMT），但其分子机制仍然不清楚。由于BCSC亚群数量通常与乳腺癌的化疗耐药性、进展、转移和复发相关，因此，探讨miR-7降低BCSC亚群的机制，有助于更深入的寻求乳腺癌治疗新策略。
ALDH1（Aldehyde dehydrogenase 1）是细胞内乙醛氧化脱氢酶，是肿瘤细胞生长、分化的必需物质，在干细胞中表达增高，对保护干细胞免受内源性毒物和外源性药物伤害及对维持干细胞干性特征起到重要作用，也可作为 CSC 的生物标志物。本课题的第一个关注点是：以ALDH1A3（ALDH家族的成员之一）作为靶基因，探讨miR-7是否能靶向ALDH1A3下调该基因表达和减低BCSC干性，试图证明ALDH1A3不仅可作为BCSC的生物标志物，还具有调节BCSC生物学功能作用。
LncRNA XIST（long noncoding RNA X-inactive specific transcript, XIST），在X染色体失活过程中发挥重要作用。XIST还与肿瘤的形成、发展密切相关，降低XIST的表达可抑制肿瘤细胞的增殖、侵袭及迁移，促进细胞凋亡，从而发挥抑癌作用。然而，癌症抑制剂miR-7是否能影响XIST的表达而抑制乳腺癌以及BCSC干性尚未见报道。本研究另一关注点是：miR-7与XIST之间是否存在相互调节以及影响BCSC表面标志物“上皮特异性抗原”（Epithelium Specific Antigen, ESA）表达，以便解析miR-7减低BCSC亚群的机制。
目的：探讨miR-7-ALDH1A3和miR-7-XIST-Slug-ESA轴减少BCSC亚群的调控机制，为靶向BCSC治疗乳腺癌提供新的理论和实验依据。
方法：
1.流式细胞仪（FCM）检测人乳腺癌BT549，MDA-MB-231细胞中ALDHbr细胞数量，免疫磁珠细胞分选法（MACS）从MDA-MB-231细胞分选出CD44+CD24?、ESA+CD44+CD24?表型的BCSC，进一步检测ALDHbr细胞数量。在MDA-MB-231细胞中转染miR-7 mimic/inhibitor、siALDH1A3后，检测ALDHbr细胞数量。生物信息学预测miR-7与ALDH1A3基因的3’UTR是否具有结合靶点，为分别构建psiCHECK2-ALDH1A3-3’UTR、psiCHECK2-ALDH1A3-3’UTR-Mut双荧光素酶质粒，在MDA-MB-231和SK-BR-3细胞内验证miR-7 mimic对ALDH1A3的靶向调节提供理论依据。构建miR-7的慢病毒过表达及对照质粒，感染MDA-MB-231细胞，经筛选后挑选Lenti-miR-7和Lentivector单克隆细胞，检测miR-7、ALDH1A3分子表达。siALDH1A3转染MDA-MB-231来源的BCSC，经FCM检测细胞表面分子表达。MACS分选ESA+CD44+CD24?Lenti-miR-7 （BCSC-Lenti-miR-7）和Lentivector（BCSC-Lentivector）细胞，检测细胞周期及其相关蛋白Cyclin D1和Ki67表达，分析miR-7对BCSC增殖能力的影响。建立BCSC-Lenti-miR-7、Lentivector-BCSC移植的非肥胖型糖尿病/严重联合免疫缺陷（NOD/SCID）荷瘤鼠模型，用RT-qPCR、Western Blot和免疫组化实验，分析瘤组织ALDH1A3等分子表达；注射siALDH1A3治疗荷瘤鼠，观察对肿瘤生长的影响。
2.生物信息学预测：miR-7与XIST之间是否存在结合靶点，miR-7与转录因子Slug 3’UTR是否有结合靶点，转录因子Slug在ESA基因启动子上游区域是否具有转录因子调节靶点。用siXIST转染MDA-MB-231细胞及其来源的BCSC，经RT-qPCR技术检测沉默XIST后对miR-7表达的影响，FCM检测BCSC比例。构建psiCHECK2-XIST1-3和psiCHECK2-XIST1-3 Mut、psiCHECK2-Slug-3’UTR和psiCHECK2-Slug-3’UTR Mut共8个双荧光素酶质粒并分别转染MDA-MB-231和LD细胞(从乳腺癌患者癌组织分离建系)，验证miR-7 mimic对XIST和Slug基因的调节效应。用染色质免疫共沉淀（ChIP-PCR）实验，验证Slug转录因子和ESA基因启动子之间是否存在结合位点。建立BCSC移植的NOD/SCID荷瘤鼠，设BCSC组、Drugs组（阿霉素+环磷酰胺）和miR-7 Agomir组，观察其对荷瘤鼠的治疗效应。RT-qPCR技术检测瘤组织XIST、Slug、ESA及miR-7等分子表达。免疫组化和Western Blot实验分析瘤组织内Slug和ESA的蛋白表达。
3. 取12例乳腺癌患者癌组织和癌旁组织，用RT-qPCR和Western Blot进一步分析人体乳腺癌中ALDH1A3、XIST、Slug、ESA、miR-7等分子表达。
结果：
1. MACS 分选的 ESA+CD44+CD24?MDA-MB-231 细胞可有效富集 ALDHbr细胞， BCSC的表面标志物和生物标志物表达趋势一致。生物信息学预测和双荧光素酶报告系统实验证实：ALDH1A3是miR-7调节靶点。miR-7 mimic可抑制ALDH1A3的表达，并有效降低MDA-MB-231细胞中ALDHbr细胞比例和BCSC表面标志物比例。构建的miR-7慢病毒过表达质粒（Lenti-miR-7），将其成功感染BCSC，RT-qPCR和Western Blot检测显示ALDH1A3分子表达显著下降。挑选单克隆BCSC并扩增，FCM分析显示， BCSC-Lenti-miR-7细胞周期G2-M期从8.12%降到1.92%，并显著减低周期蛋白Cyclin D1和Ki-67的分子表达，表明miR-7可有效降低BCSC的增殖活力，减低BCSC的干 性。NOD/SCID小鼠体内实验证实：BCSC-Lenti-miR-7的生物标志物ALDH1A3和细胞表面标志物ESA等表达，与 BCSC-Lentivector 对照组相比显著下降，肿瘤生长受到显著抑制。同时，在2×105个BCSC皮下注射NOD/SCID鼠成瘤后，注射siALDH1A3可抑制BCSC所致的荷瘤鼠生长。
2.在MDA-MB-231细胞和LD细胞中，经双荧光素酶报告系统检测证实：XIST和miR-7之间存在互为负性调节。Slug的3’ UTR基因上具有miR-7调节靶点，用miR-7 mimic 可下调转录因子Slug基因表达。在MDA-MB-231细胞中，通过miR-7过表达和下调XIST证明，miR-7与XIST之间存在相互抑制效应。ChIP-PCR证实：Slug可结合到 ESA 启动子上游区域，增强 ESA 基因表达。以上实验说明，miR-7-XIST 参与调节Slug表达，而Slug作为转录因子调控BCSC表面标志分子ESA的表达，从而影响BCSC亚群比例。另外，siXIST可抑制BCSC的细胞周期（G2-M期），提示XIST与BCSC增殖相关。2×105个BCSC皮下注射NOD/SCID鼠乳垫成瘤，miR-7 Agomir作为靶向药物治疗荷瘤鼠，有效抑制肿瘤生长和瘤体细胞Slug和ESA表达，与对照组相比有统计学意义（p＜0.05）。
3. 检测12例乳腺癌患者组织发现，相较于癌旁组织，癌组织内ALDH1A3、XIST、Slug 和 ESA 四种 mRNA 表达与 miR-7 表达呈负相关，癌组织内 ALDH1A3、Slug 和ESA三种蛋白分子表达明显增高。
结论：
1.miR-7对ALDH1A3、Slug和ESA分子具有靶向调控作用；miR-7与XIST之间存在相互调节作用，从而影响BCSC亚群比例。
2.体外和体内实验证明：ALDH1A3、XIST、Slug和ESA等基因表达与BCSC亚群数呈正相关；miR-7表达与BCSC亚群数呈负相关。
3.miR-7能抑制ALDH1A3活性减低BCSC生物标志物，并能抑制Slug而下调ESA表达，进而减低BCSC表面标志物，导致BCSC亚群比例减少。
这些研究发现，可能为miR-7靶向ALDH1A3、XIST与Slug，进而减少BCSC亚群数量治疗乳腺癌，提供了新的思路。
ALDH1（Aldehyde dehydrogenase 1）是细胞内乙醛氧化脱氢酶，是肿瘤细胞生长、分化的必需物质，在干细胞中表达增高，对保护干细胞免受内源性毒物和外源性药物伤害及对维持干细胞干性特征起到重要作用，也可作为 CSC 的生物标志物。本课题的第一个关注点是：以ALDH1A3（ALDH家族的成员之一）作为靶基因，探讨miR-7是否能靶向ALDH1A3下调该基因表达和减低BCSC干性，试图证明ALDH1A3不仅可作为BCSC的生物标志物，还具有调节BCSC生物学功能作用。
LncRNA XIST（long noncoding RNA X-inactive specific transcript, XIST），在X染色体失活过程中发挥重要作用。XIST还与肿瘤的形成、发展密切相关，降低XIST的表达可抑制肿瘤细胞的增殖、侵袭及迁移，促进细胞凋亡，从而发挥抑癌作用。然而，癌症抑制剂miR-7是否能影响XIST的表达而抑制乳腺癌以及BCSC干性尚未见报道。本研究另一关注点是：miR-7与XIST之间是否存在相互调节以及影响BCSC表面标志物“上皮特异性抗原”（Epithelium Specific Antigen, ESA）表达，以便解析miR-7减低BCSC亚群的机制。
目的：探讨miR-7-ALDH1A3和miR-7-XIST-Slug-ESA轴减少BCSC亚群的调控机制，为靶向BCSC治疗乳腺癌提供新的理论和实验依据。
方法：
1.流式细胞仪（FCM）检测人乳腺癌BT549，MDA-MB-231细胞中ALDHbr细胞数量，免疫磁珠细胞分选法（MACS）从MDA-MB-231细胞分选出CD44+CD24?、ESA+CD44+CD24?表型的BCSC，进一步检测ALDHbr细胞数量。在MDA-MB-231细胞中转染miR-7 mimic/inhibitor、siALDH1A3后，检测ALDHbr细胞数量。生物信息学预测miR-7与ALDH1A3基因的3’UTR是否具有结合靶点，为分别构建psiCHECK2-ALDH1A3-3’UTR、psiCHECK2-ALDH1A3-3’UTR-Mut双荧光素酶质粒，在MDA-MB-231和SK-BR-3细胞内验证miR-7 mimic对ALDH1A3的靶向调节提供理论依据。构建miR-7的慢病毒过表达及对照质粒，感染MDA-MB-231细胞，经筛选后挑选Lenti-miR-7和Lentivector单克隆细胞，检测miR-7、ALDH1A3分子表达。siALDH1A3转染MDA-MB-231来源的BCSC，经FCM检测细胞表面分子表达。MACS分选ESA+CD44+CD24?Lenti-miR-7 （BCSC-Lenti-miR-7）和Lentivector（BCSC-Lentivector）细胞，检测细胞周期及其相关蛋白Cyclin D1和Ki67表达，分析miR-7对BCSC增殖能力的影响。建立BCSC-Lenti-miR-7、Lentivector-BCSC移植的非肥胖型糖尿病/严重联合免疫缺陷（NOD/SCID）荷瘤鼠模型，用RT-qPCR、Western Blot和免疫组化实验，分析瘤组织ALDH1A3等分子表达；注射siALDH1A3治疗荷瘤鼠，观察对肿瘤生长的影响。
2.生物信息学预测：miR-7与XIST之间是否存在结合靶点，miR-7与转录因子Slug 3’UTR是否有结合靶点，转录因子Slug在ESA基因启动子上游区域是否具有转录因子调节靶点。用siXIST转染MDA-MB-231细胞及其来源的BCSC，经RT-qPCR技术检测沉默XIST后对miR-7表达的影响，FCM检测BCSC比例。构建psiCHECK2-XIST1-3和psiCHECK2-XIST1-3 Mut、psiCHECK2-Slug-3’UTR和psiCHECK2-Slug-3’UTR Mut共8个双荧光素酶质粒并分别转染MDA-MB-231和LD细胞(从乳腺癌患者癌组织分离建系)，验证miR-7 mimic对XIST和Slug基因的调节效应。用染色质免疫共沉淀（ChIP-PCR）实验，验证Slug转录因子和ESA基因启动子之间是否存在结合位点。建立BCSC移植的NOD/SCID荷瘤鼠，设BCSC组、Drugs组（阿霉素+环磷酰胺）和miR-7 Agomir组，观察其对荷瘤鼠的治疗效应。RT-qPCR技术检测瘤组织XIST、Slug、ESA及miR-7等分子表达。免疫组化和Western Blot实验分析瘤组织内Slug和ESA的蛋白表达。
3. 取12例乳腺癌患者癌组织和癌旁组织，用RT-qPCR和Western Blot进一步分析人体乳腺癌中ALDH1A3、XIST、Slug、ESA、miR-7等分子表达。
结果：
1. MACS 分选的 ESA+CD44+CD24?MDA-MB-231 细胞可有效富集 ALDHbr细胞， BCSC的表面标志物和生物标志物表达趋势一致。生物信息学预测和双荧光素酶报告系统实验证实：ALDH1A3是miR-7调节靶点。miR-7 mimic可抑制ALDH1A3的表达，并有效降低MDA-MB-231细胞中ALDHbr细胞比例和BCSC表面标志物比例。构建的miR-7慢病毒过表达质粒（Lenti-miR-7），将其成功感染BCSC，RT-qPCR和Western Blot检测显示ALDH1A3分子表达显著下降。挑选单克隆BCSC并扩增，FCM分析显示， BCSC-Lenti-miR-7细胞周期G2-M期从8.12%降到1.92%，并显著减低周期蛋白Cyclin D1和Ki-67的分子表达，表明miR-7可有效降低BCSC的增殖活力，减低BCSC的干 性。NOD/SCID小鼠体内实验证实：BCSC-Lenti-miR-7的生物标志物ALDH1A3和细胞表面标志物ESA等表达，与 BCSC-Lentivector 对照组相比显著下降，肿瘤生长受到显著抑制。同时，在2×105个BCSC皮下注射NOD/SCID鼠成瘤后，注射siALDH1A3可抑制BCSC所致的荷瘤鼠生长。
2.在MDA-MB-231细胞和LD细胞中，经双荧光素酶报告系统检测证实：XIST和miR-7之间存在互为负性调节。Slug的3’ UTR基因上具有miR-7调节靶点，用miR-7 mimic 可下调转录因子Slug基因表达。在MDA-MB-231细胞中，通过miR-7过表达和下调XIST证明，miR-7与XIST之间存在相互抑制效应。ChIP-PCR证实：Slug可结合到 ESA 启动子上游区域，增强 ESA 基因表达。以上实验说明，miR-7-XIST 参与调节Slug表达，而Slug作为转录因子调控BCSC表面标志分子ESA的表达，从而影响BCSC亚群比例。另外，siXIST可抑制BCSC的细胞周期（G2-M期），提示XIST与BCSC增殖相关。2×105个BCSC皮下注射NOD/SCID鼠乳垫成瘤，miR-7 Agomir作为靶向药物治疗荷瘤鼠，有效抑制肿瘤生长和瘤体细胞Slug和ESA表达，与对照组相比有统计学意义（p＜0.05）。
3. 检测12例乳腺癌患者组织发现，相较于癌旁组织，癌组织内ALDH1A3、XIST、Slug 和 ESA 四种 mRNA 表达与 miR-7 表达呈负相关，癌组织内 ALDH1A3、Slug 和ESA三种蛋白分子表达明显增高。
结论：
1.miR-7对ALDH1A3、Slug和ESA分子具有靶向调控作用；miR-7与XIST之间存在相互调节作用，从而影响BCSC亚群比例。
2.体外和体内实验证明：ALDH1A3、XIST、Slug和ESA等基因表达与BCSC亚群数呈正相关；miR-7表达与BCSC亚群数呈负相关。
3.miR-7能抑制ALDH1A3活性减低BCSC生物标志物，并能抑制Slug而下调ESA表达，进而减低BCSC表面标志物，导致BCSC亚群比例减少。
这些研究发现，可能为miR-7靶向ALDH1A3、XIST与Slug，进而减少BCSC亚群数量治疗乳腺癌，提供了新的思路。