【摘 要】
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非病毒基因递送系统常依赖转染材料将外源基因导入靶细胞、实现外源基因的转染与表达。因此,低毒、高效转染材料的开发与应用是基因工程的技术瓶颈和研究热点之一。聚乙烯亚胺（Polyethyleneimine,PEI）是目前最常用的非病毒转染材料之一。虽然PEI具有转染效率高的优点,但高细胞毒性限制了其广泛应用。针对PEI的这一缺陷,本论文研究通过化学改性策略构建新型PEI衍生物,发展低毒高效的基因递送转染
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非病毒基因递送系统常依赖转染材料将外源基因导入靶细胞、实现外源基因的转染与表达。因此,低毒、高效转染材料的开发与应用是基因工程的技术瓶颈和研究热点之一。聚乙烯亚胺（Polyethyleneimine,PEI）是目前最常用的非病毒转染材料之一。虽然PEI具有转染效率高的优点,但高细胞毒性限制了其广泛应用。针对PEI的这一缺陷,本论文研究通过化学改性策略构建新型PEI衍生物,发展低毒高效的基因递送转染材料,取得以下主要结果:（1）制备获得低细胞毒性的新型PEI衍生物。以高转染效率的PEI25k为骨架,用高生物相容性的聚乳酸羟基乙酸（Polylactic-co-glycolic acid,PLGA）（50:50,4000）与其末端的伯胺基进行脱水缩合修饰反应。红外光谱与核磁共振氢谱分析表明,所得产物为通过PEI25k的游离伯胺基与PLGA（50:50,4000）的末端羧基之间反应生成酰胺键而形成PEI衍生物PEI-PLGA。进一步分析表明,与未修饰的PEI相比,PEI-PLGA具有一定质子缓冲能力且细胞毒性低。当PEI-PLGA与DNA质量比达到0.3:1时,凝胶电泳分析发现PEI-PLGA与重组杆粒Anpe NPV-bacmid-e GFP结合形成DNA完全复合物;马尔文粒度仪检测结果表明,复合物的粒径减小到200 nm左右,并保持稳定;当质量比达到5:1时,电位达到最大正值,且不再有明显变化。扫描电镜检测发现,当PEI-PLGA与DNA质量比为5:1时,复合物的形态呈球形、分散度较好、粒径大小在220 nm左右。这些结果提示,新型PEI衍生物PEI-PLGA可能是低细胞毒性的基因递送材料。（2）表征发现PEI-PLGA衍生物具有基因递送作用。将PEI-PLGA与Anpe NPV-bacmid-e GFP杆粒混合孵育得到的PEI-PLGA/Anpe NPV-bacmid-e GFP复合物,分别转染Tn-High 5细胞4天和柞蚕蛹14天后,观察到绿色荧光出现;SDS-PAGE丙烯酰胺凝胶电泳结合考马斯亮蓝染色分析发现,柞蚕蛹血淋巴蛋白中出现外源蛋白e GFP特异条带;终点稀释法测定发现柞蚕蛹体内的重组杆状病毒病毒滴度为2.50×10~8 pfu/m L,证明携带绿色荧光蛋白e GFP标签的重组杆粒Anpe NPV-bacmid-e GFP转染成功,且转染柞蚕蛹体内产生的重组杆状病毒具有二次感染宿主能力。进一步利用q PCR检测Tn-High 5细胞和柞蚕蛹血淋巴全基因组中重组杆粒DNA的含量,评价PEI-PLGA作为基因递送材料的转染能力,结果表明:PEI-PLGA转染细胞和柞蚕蛹的效率均高于PEI;PEI-PLGA的转染效率随着PEI-PLGA与DNA质量比的增大而逐渐升高,在质量比为5:1时转染Tn-High 5细胞的效率达到最高值,在质量比达到30:1时转染柞蚕蛹的效率达到最大值。上述结果证明PEI衍生物PEI-PLGA是具有体内和体外基因递送作用的新型高效转染材料。（3）优化PEI-PLGA制备条件。以转染荧光量（copies/μL）作为评价指标,分别通过单因素实验和响应曲面实验探究了转染材料PEI-PLGA的最佳制备条件。对PEI-PLGA制备条件中的反应温度（℃）、反应时间（h）、PLGA:PEI三个因素分别进行探究,确定了最适单因素条件:反应温度25℃、反应时间24 h、PLGA:PEI=4;在单因素基础上,通过响应曲面法的Box-Behnken中心组合实验优化PEI-PLGA的制备条件,得出了荧光量（copies/μL）对反应温度（℃）、反应时间（h）、PLGA:PEI三个因素的二次多项式模型,对模型进行方差分析,发现该模型具有极显著性、相关系数高,模型的预测值与实际值之间具有较好的拟合度;通过计算模型的最佳点,得出PEI-PLGA的最佳制备条件:反应温度24.77℃、反应时间25.77 h、PLGA:PEI=4.1。综上结果,以Tn-High 5细胞和柞蚕蛹为实验对象,本论文用PLGA（50:50,4000）对PEI25k进行化学修饰,制备了转染效率高、细胞毒性低的新型转染材料PEI-PLGA,并优化PEI-PLGA的制备条件,为建立安全高效的非病毒基因递送系统提供了新的转染材料,也为新转染材料的设计提供了新思路,同时,PEI-PLGA可以直接转染柞蚕蛹获得重组杆状病毒,简化了现有的杆状病毒表达系统,为杆状病毒在昆虫中的应用提供新方向。
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