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中国是世界第一大鲟鱼养殖国,西南地区丰富的亚冷水资源促进了鲟鱼养殖产业的区域化快速发展。以西伯利亚鲟(Acipenser baerii)为母本繁育的杂交鲟是当前鲟鱼产业的主要养殖品种,而冬春季亲鱼人工繁殖手术后的细菌感染问题成为影响西伯利亚鲟亲本储备的瓶颈。细菌性疾病是危害鲟鱼养殖的重要传染性疾病之一,混合感染是临床疾病研究关注的热点,然而非致死性菌株在混合感染病程发展中的作用和影响鲜有报道。本研究在临床表现为细菌性败血症的西伯利亚鲟亲本病例中,通过微生物学和病理学实验技术,明确了疾病病原菌;针对其中发现的非致病乳球菌JLlg08PX,进一步测序获得了其全基因组序列,并进行了基因组组分分析和基因注释,通过16S r RNA(16S ribosomal RNA)基因全长序列发育树构建、平均核苷酸序列一致性(Average nucleotide identity,ANI)和数字DNA杂交(Digital DNA-DNA hybridization,d DDH)分析,准确鉴定乳球菌至种水平,并将5株格氏乳球菌进行重新分类。为丰富乳球菌JLlg08PX的生物学特性,通过细菌培养实验开展生长曲线测定、形态观察和培养条件耐受分析,通过VITEK?2革兰氏阳性鉴定卡(GP)分析菌株生化特性,采用耐酸和耐胆盐实验分析菌株胃肠道抵抗特性,结合菌株无细胞上清液(Cell-Free Supernatant,CFS)体外抑菌实验和菌株共感染体内气单胞菌载量实验分析菌株抑菌特性。主要研究结果如下:1.非致病乳球菌的发现从5尾术后濒死西伯利亚鲟的围心腔、肝脏、中肾和脾脏中分离纯化获得JLAHX和JLlg X两种细菌。细菌JLAHX具有β溶血活性,携带溶血素(hemolysin,hly A)和细胞毒性肠毒素(cytotoxic enterotoxin,alt)毒力基因,而细菌JLlg X不具有溶血活性;16S r RNA基因通用引物扩增序列比对和系统发育树分析鉴定细菌JLAHX为嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila),而细菌JLlg X与乳球菌属细菌序列相似性高于99%并聚为一簇,但无法进行种水平上的区分。有趣的是动物回归感染实验显示,乳球菌(Lactococcus sp.)组以4.0×10~7CFU/fish腹腔注射杂交鲟(西伯利亚鲟♀×史氏鲟♂)累计死亡率为0%;且乳球菌和嗜水气单胞菌共感染后,杂交鲟死亡率由嗜水气单胞菌单独感染的77.78%~88.89%降低至33.33%。组织病理学观察发现共感染组中由嗜水气单胞菌感染引起的肝细胞坏死和瓣肠粘膜损伤得到改善。菌株致病性实验中1.0×10~8CFU/fish或5.74×10~7CFU/ml的乳球菌JLlg08PX分别通过腹腔注射、灌胃口服和浸泡三种方式感染西伯利亚鲟,14 d内均未观察到死亡现象和临床症状,感染后14 d仅在腹腔注射组有16.67%的乳球菌检出率。以上研究结果表明亲鱼细菌性败血症病原为嗜水气单胞菌,而乳球菌则不致病,且乳球菌共感染可缓解嗜水气单胞菌引起的鲟发病死亡率和组织病理损伤。2.乳球菌JLlg08PX全基因组测序及分析乳球菌JLlg08PX基因组由一个2113250 bp的染色体和一个45868 bp的质粒组成,基因组总长度为2159118 bp,GC含量为38.01%,预测编码基因2132个。乳球菌JLlg08PX基因组中预测到59个r RNA、16个t RNA和35个s RNA并获得基因组中串联重复序列、散在重复序列、基因组岛和前噬菌体的预测信息;同时,COG、GO、KEGG、CARD和PHI数据库分别有1790、1520、1160、114和449个基因得到注释。值得注意的是,乳球菌JLlg08PX与蜜袋鼯乳球菌(L.petauri)159469株、LZys1株和CF11株的ANI值大于96%,分别为98.55%、98.32%和98.15%;d DDH值大于70%,分别为86.00%、84.30%和83.80%。因此,结果表明乳球菌JLlg08PX为蜜袋鼯乳球菌。此外,格氏乳球菌(L.garvieae)ERR1600742-bin.28株、FDAARGOS1002株、FDAARGOS1062株、FDAARGOS1063株和MGYG-HGUT-00230株与蜜袋鼯乳球菌JLlg08PX的ANI和d DDH值分别大于96%和70%。因此,以蜜袋鼯乳球菌JLlg08PX全基因组序列为参照,将这5株菌重新鉴定为蜜袋鼯乳球菌。3.蜜袋鼯乳球菌JLlg08PX生物学特性分析蜜袋鼯乳球菌JLlg08PX在TSB培养基中28℃180 r/min培养2 h进入对数期,6 h达到稳定期;在BHIA和MRSA培养基上生长形成半透明、边缘整齐、圆形凸起、表面湿润的乳白色菌落;细菌为卵圆形,平均大小为1.00±0.13μm×0.63±0.03μm,呈单个或链状分布;菌株在温度18~45℃、p H 7~11和Na Cl(w/v)2%~6%的培养条件下生长。在p H=4的酸性条件下培养3 h,细菌存活率为56.65±11.10%;在0.2%、0.3%和0.4%胆盐环境下培养表现出良好的耐受性。此外,体外抑菌实验显示,蜜袋鼯乳球菌JLlg08PX的CFS能抑制嗜水气单胞菌、维氏气单胞菌(A.veronii)和鲁氏耶尔森氏菌(Yersinia ruckeri)的生长,而对无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)的生长无影响。综上,本研究从西伯利亚鲟亲鱼中获得了一株非致病的蜜袋鼯乳球菌JLlg08PX,通过对该菌株的致病性研究和生物学特性分析,丰富了蜜袋鼯乳球菌的基础数据,为混合感染中非致死菌株对病程发展的影响提供新的思路。