在脊椎动物的进化历程中，先后产生了前肾、中肾和后肾三种形式的肾脏。虽然不同形式的肾脏在器官形态上存在很大差异，但在细胞组成、分布和分子调控水平上具有很多共性。斑马鱼前肾简单又具备正常的生理功能，是研究肾脏发育、肾脏功能及肾脏疾病的理想模型。斑马鱼作为经典的模式动物，具有易于饲养、子代高产、胚胎体外发育且半透明便于观察、性成熟早等优点，是目前脊椎动物中最适合进行大规模遗传筛选的材料。由于与人类在进化上较近的亲缘性，小鼠是肾脏发育研究的主要模式生物，但是小鼠肾脏结构复杂、胚胎体内发育及采用的技术手段的局限性，使得肾脏发育的研究还有很多空白。　　我们针对斑马鱼前肾缺陷突变体进行了遗传筛选，以便系统地无基因歧视地研究肾脏发育的分子调控机制，并有望发现全新的调控因子及分子机制。此次筛选我们利用高效而又无位点偏好性的化学诱变剂ENU对斑马鱼进行诱变处理，采用经典的F2家系自交产生F3代胚胎筛选隐性突变体的策略。已报道的斑马鱼肾脏突变体筛选均采用显微镜下直接进行形态学观察的方法，在本研究中我们通过碱性磷酸酶底物染色来标记斑马鱼前肾肾管，这样可以更加特异性地观察肾管形态。在完成了212个突变基因组的筛选，并经过两次传代纯化遗传背景后，我们最终获得了37个突变品系，根据其表型特征将其分为四类：肾囊肿型突变体，肾管短粗型突变体，水肿型突变体和其它型突变体。为了检测突变体中肾小球发育状态，我们以podocin为探针对这37个突变品系进行原位杂交。初步结果显示超过半数的突变体的肾小球不存在缺陷，这表明肾管与肾小球的发育可能涉及不同的基因调控网络，但也存在共通之处。　　在完成筛选以后，我们挑选了AB遗传背景下的V3-5（肾囊肿型）、V47（肾管短粗型）、L27（水肿型）等三个突变体与WIK品系杂交建立了mapping家系，采用经典的图位克隆法对V3-5和L27进行突变基因的克隆。V3-5突变体因遗传背景等原因，其mapping品系中突变体表型出现比例很低，突变体胚胎的收集较为困难。我们通过群体分离分析法（BSA）将突变位点定位在第二十三号染色体上。因突变体胚胎数目较少，染色体步移（Chromosomal Walking）缩小候选区域进展缓慢，我们最终采用了基于RNA-seq寻找突变位点的方法，目前测序数据正在分析中。在L27突变体的mapping家系中，我们通过对3497个突变体胚胎的重组性分析，最终将突变位点锁定在斑马鱼第十三号染色体上一个长约0.662Mb的区域，此区域包含15个编码基因，我们将通过DNA测序逐一鉴定候选基因。V47突变体目前还在收集突变体胚胎阶段。　　L27突变体表型分析结果表明突变体肾管的近端小管可以正常分化，但其形态呈平行直管状并距胸鳍较远；其肾小球足细胞及颈部特异性marker表达下调或缺失。这种表型与已报道的敲降wt1a/b或osr1产生的表型相似。L27图位克隆确定的候选基因均未有肾小球发育调控功能的报道，这显示L27突变基因是一个调控肾小球及肾管颈部分化的新因子。　　除了正向遗传筛选之外，我们还采用基因敲除方式初步研究了lhx1a在斑马鱼肾脏发育中的功能。通过RNA原位杂交的方法，我们首先对lhx1a的时空表达模式进行了分析，结果显示lhx1a具有母源性，在早期的前肾及其前体中均有表达，随着肾管节段化完成，lhx1a在肾脏中的表达急剧下调直致无法检测。敲除lhx1a会导致wt1a的表达逐渐丧失、podocin的表达完全缺失以及pax2a表达的下调甚至部分缺失，而肾管发生是正常的。这些结果表明lhx1a是肾小球足细胞发生所必需的，但对于肾管是非必需的。令人意外的是，注射lhx1a mRNA不仅无法挽救lhx1a突变体表型，还会造成野生型和杂合子胚胎中podocin表达的下调甚至缺失。这显示过量的lhx1a的表达会抑制肾小球足细胞的终末分化。　　本研究工作将会发现一个新的肾脏发育调控因子，并为深入阐释肾脏发生的分子机制打下坚实的基础，加深我们对肾脏发生的认识。