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病毒使用不同的策略逃避包括诱导免疫抑制在内的免疫监视,最大限度的提高其生存、复制和传播机会,对宿主产生严重临床后果,并引起继发性感染。因此,了解诱导免疫抑制机制对控制人和动物病毒感染至关重要。小反刍兽疫(Peste des petits ruminants,PPR)是由小反刍兽疫病毒(Peste des petits ruminants virus,PPRV)引起的主要感染绵羊、山羊等小反刍动物的重要传染病,因其极高的发病率和死亡率,严重威胁养羊业,被世界动物卫生组织(Office international des epizooties,OIE)列为必须报告的疾病。本研究的目的是探究PPRV非结构蛋白V在天然免疫中的作用机制。利用实时荧光定量PCR技术(Real-time fluorescence quantitative PCR,qPCR),检测了V基因在转录水平对维甲酸诱导基因I样受体(Retinoic-acid-inducible gene I like receptor,RLRs)信号通路中RIG-I介导的干扰素(Interferon,IFN)及其下游因子的作用;双荧光素酶报告系统检测了V蛋白在RLRs通路中的作用靶点;qPCR和蛋白免疫印迹(Western blot,WB)进一步研究了V蛋白对内源、外源性IFN介导的抗病毒作用;WB研究了V蛋白对干扰素调节因子3(Interferon regulatory factor 3,IRF3)和信号传导及转录激活因子1(Signal transducers and activators of transcription 1,STAT1)磷酸化的影响。最后,构建了PPRV全长cDNA克隆及V基因突变全长cDNA克隆。获得以下研究结果:1.PPRV V蛋白抑制RLRs信号通路介导的INF-β的生成及其下游因子基因转录水平的表达。共转染pRK-Flag-RIG-IN和pcDNA3.1-HA-V至HEK293T细胞,qPCR检测表明PPRV V蛋白极显著抑制RLRs信号通路介导的INF-β的生成及其下游因子干扰素诱导基因56(Interferon stimulated gene,ISG56)、ISG15、CXC趋化因子配体10基因(C-X-C motif chemokine 10 gene,CXCL10)在基因转录水平的表达(p<0.001)。2.双荧光素酶报告基因系统检测表明PPRV V蛋白在细胞内的过表达极显著抑制RLRs通路中干扰素刺激反应原件(Interferon-stimulated response elements,ISRE)报告基因活性(p<0.001),表明V蛋白在RLRs通路中可抑制IFN的产生。3.PPRV V蛋白可显著减少内源、外源性IFN产生抑制HEV、PPRV和EMCV的抗病毒作用。共转染pcDNA3.1-HA-V和pRK-Flag-RIG-IN至HEK293T细胞和Huh7-p6细胞24 h后收集上清分别加入到新培养的细胞中继续培养24 h后,在HEK293T细胞中接种PPRV和脑心肌炎病毒(Encephalomyocarditis virus,EMCV)于12 h、24 h、36 h收取细胞,在Huh7-p6细胞中接种戊型肝炎病毒(Heptitis E virus,HEV)于18 h和36h收取细胞,qPCR检测表明PPRV V蛋白在18 h可以极显著增加HEV的复制(p<0.001),36 h时不影响病毒复制(p>0.05),V蛋白在三个时间段都显著促进PPRV和EMCV复制(p<0.01),表明PPRV V蛋白可显著抑制内源性IFN产生的抗病毒作用。共转染pcDNA3.1-HA-V和pRK-Flag-RIG-IN至HEK293T细胞和Huh7-p6细胞24 h后加入商品化IFN-β(1000 U/mL)和IFN-α-2b(1000 U/mL)处理细胞,在24 h后分别感染三种病毒,qPCR和WB检测表明V蛋白明显增加细胞中三种病毒mRNA的表达(p<0.05),说明PPRV V蛋白可显著抑制外源性IFN产生的抗病毒作用。4.PPRV V通过阻断JAK-STAT途径抑制IFN的抗病毒作用。WB检测表明HEK293T细胞中转染pRK-Flag-RIG-IN增强IRF3磷酸化,转染pcDNA3.1-HA-V降低p369-IRF3和p701-STAT1磷酸化,表明PPRV V蛋白通过抑制JAK-STAT通路中IRF3和STAT1磷酸化减少IFN的产生。5.构建了PPRV 16153 bp全长cDNA克隆及V基因突变全长cDNA克隆。根据PPRV基因组序列的保守性,在基因组3’端引入锤头状核酶序列(the Hammerhead ribozyme sequence,HamRz),在5’端引入T7终止子和丁型肝炎核酶序列(the Hepatitis delta virus ribozyme sequence,HdvRz),运用RT-PCR扩增出病毒7个片段,互相连接获得了全长cDNA克隆(pBluescript SK-PPRV)和V基因突变全长cDNA克隆(pBluescript SK-PPRV△V)。本文研究了PPRV非结构蛋白V在宿主细胞内介导的天然免疫抑制机制,明确了V蛋白抑制RLRs通路中RIG-I介导的IFNs产生的基本分子机制,从而得出结论V蛋白在JAK-STAT途径中可抑制STAT1和IRF3磷酸化产生IFN的抗病毒作用,构建了PPRV全长cDNA克隆及V基因突变全长cDNA克隆,这些结果对进一步阐明PPRV非结构蛋白介导的天然免疫作用机制奠定了基础。