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本文主要从以下几方面进行了论述: 第一部分 目的:探讨凝血酶诱导小胶质细胞激活与黑质多巴胺(DA)能神经元变性的关系。 方法:将凝血酶注射入大鼠黑质或干预中脑腹侧混合培养体系。于不同时间点采用尼氏(Nissl)染色,抗酪氨酸羟化酶(TH)抗体、特异性抗OX-42标记抗体免疫组织化学染色,观察凝血酶作用后不同时间点TH阳性多巴胺能神经元变化、小胶质细胞的激活情况;Western blot检测体内黑质Bcl-2和Bax蛋白表达。离体部分将凝血酶干预中脑腹侧混合培养体系,用TH抗体、抗Caspase-3抗体免疫荧光细胞染色,观察凝血酶作用后不同时间点TH阳性多巴胺能神经元变化及Caspase-3激活情况并进行DA摄取能力的检测。 结果:凝血酶注入黑质4h后小胶质细胞开始呈现为―灌木丛样‖或少量呈现阿米巴样;12h小胶质细胞数目明显增加且绝大部分呈现阿米巴样;24h已完全激活,“阿米巴样‖细胞达高峰;3d维持高峰;14d后小胶质细胞染色变淡,体积变小,阿米巴样细胞数目下降。而TH阳性细胞数在第3d开始下降,第7d有大量的TH阳性细胞丢失,与对照侧相比下降达约53％(P<0.01),高倍镜下可见胞体皱缩、突起明显缩短或减少,14d时细胞数下降至21%,30d时约为12%(P<0.01)。凝血酶注射24h导致黑质致密部Bcl-2蛋白表达明显减少;而Bax蛋白表达无明显变化,Bax/Bcl-2比值出现上升,与对照比较有显著差异(P<0.05)。在中脑腹侧混合培养体系,20U/ml凝血酶处理共培养物24h后,诱导多巴胺能神经元变性,TH免疫反应阳性细胞数目减少(下降36%),并引起细胞皱缩而突起明显缩短和天门冬氨酸半胱氨酸蛋白酶-3(Caspases-3)激活,并且呈剂量依赖性的抑制[3H]DA摄取能力,5U/ml凝血酶处理并不影响[3H]DA摄取,而用10-40U/ml凝血酶处理抑制[3H]DA摄取为50-70%。 结论:凝血酶对DA能神经元具有一定的损毁作用,Bcl-2及Caspase-3参与了凝血酶诱导的DA能神经元变性,小胶质细胞的激活先于DA能神经元变性,其活化可能参与DA能神经元变性。 第二部分 目的:探讨凝血酶诱导小胶质细胞激活后肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)、诱导型一氧化氮合酶(Induced nitricoxide synthase,iNOS)表达及一氧化氮(nitricoxide,NO)释放的变化。 方法:将凝血酶注射入大鼠黑质或干预小胶质细胞或中脑腹侧混合培养体系,于不同时间采用逆转录聚合酶链式反应RT-PCR检测细胞iNOS、TNF-α mRNA表达;Western-blot检测iNOS蛋白的表达;酶联免疫吸附(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)法检测上清液TNF-α含量;激光共聚焦定位iNOS或TNF-α的表达;使用酶法测定组织或细胞培养上清中的NO的浓度。 结果:凝血酶组注射侧黑质和细胞培养上清中的NO含量显著升高(P<0.05),iNOS和TNF-αmRNA和蛋白的表达也显著升高(P<0.05)。共聚焦显示凝血酶注射入黑质24h后iNOS定位在激活的小胶质细胞,干预中脑腹侧混合培养体系12h后,iNOS或TNF-α与小胶质细胞共聚。小胶质细胞激活和释放的毒性因子先于多巴胺能神经元变性。 结论:凝血酶诱导小胶质细胞前炎症因子和NO的表达,可能参与了DA能神经元变性。 第三部分 目的:探讨凝血酶诱导小胶质细胞激活与JAK-STAT信号途径的关系。 方法:凝血酶处理原代培养的小胶质细胞或中脑腹侧混合培养体系,用Western Blot检测小胶质细胞JAK1、P-JAK1、P-JAK2、P-STAT3、STAT3的表达;激光共聚焦观察P-STAT3的亚细胞定位。在凝血酶立体定向注射入大鼠黑质2 h-24 h后,共聚焦双标染色观察P-STAT3、P-JAK2的表达。 结果:体外Western blot显示凝血酶处理2h后快速诱导JAK2、STAT3的磷酸化,12h到峰值,24h回到基础水平;并且P-STAT3定位在激活的小胶质细胞内。而在凝血酶处理后STAT3、JAK2的总量保持不变,JAK1的磷酸化根本不出现。体内共聚焦双标免疫荧光染色结果提示在凝血酶注射侧2 h后P-STAT3、P-JAK2均开始被激活,24h逐渐达高峰并且定位在激活的小胶质细胞。 结论:凝血酶诱导小胶质细胞JAK2-STAT3信号途径的激活,STAT3的激活依赖于JAK2的激活。 第四部分 目的:探讨AG490与JAK/STAT途径的关系及其对凝血酶诱导的小胶质细胞活化导致多巴胺神经元变性的保护作用。 方法:用凝血酶或AG490预处理加凝血酶处理小胶质细胞或中脑腹侧混合培养体系和黑质,MTT法检测AG490对纯小胶质细胞增殖的影响;用RT-PCR、Western Blot、ELISA分析检测小胶质细胞P-JAK1、P-JAK2、P-STAT3、STAT3、iNOS、TNF-α、Bax及Bcl-2的表达;激光共聚焦观察P-STAT3、iNOS和TNF-α的表达和定位,细胞上清NO含量的测定;免疫荧光或TH组织化学染色观察Caspase-3的表达及多巴胺神经元的变性。 结果:在体外,以上方法显示在相同时间处理组,AG490预处理可抑制凝血酶导致的小胶质细胞增殖,显著地减少JAK2和STAT3、iNOS、TNF-α及细胞上清NO的含量,并且减少Caspase-3的表达,缓解多巴胺能神经元的变性。同时,Western blots检测显示在大鼠黑质AG490预处理明显抑制凝血酶(在12h)诱导的STAT3、P-JAK2的磷酸化水平,增加Bcl-2的表达,TH阳性细胞数明显增多。 结论:AG490预处理可抑制JAK2-STAT3途径,减少iNOS、TNF-α、Caspase-3及NO的表达或增加抗凋亡基因Bcl-2的表达,减轻多巴胺神经元变性。