目的(1)验证应用密度梯度离心法获取兔骨髓间充质干细胞(BMSCs),并定向诱导为成骨细胞；(2)观察成骨诱导后的骨髓间充质干细胞在猪小肠粘膜下层(small intestinal submucosa, SIS)上粘附及生长情况,证实体外构建组织工程骨膜切实可行；(3)评价组织工程骨膜体内成骨修复兔大段骨缺损及同种异体脱蛋白骨(deproteinized bone, DPB)作为组织工程骨膜辅助支架材料的效果。方法(1)取1月龄清洁级新西兰大白兔,采用密度梯度离心法分离培养BMSCs,以成骨诱导培养液诱导其向成骨细胞分化；(2)理化方法处理制备SIS及DPB,将向成骨细胞分化后的BMSCs与SIS复合构建组织工程骨膜,扫描电镜观察细胞与SIS复合情况。取新鲜同种异体骨段细密打孔后进行脱蛋白处理,制成DPB支架材料。将组织工程骨膜呈“外套状”包被DPB,并用可吸收缝合线捆扎,制备成组织工程骨膜/DPB复合体。(3)取4月龄清洁级新西兰大白兔48只,随机分成A、B、C、D4组(每组12只),切除左侧桡骨干3.5cm骨段制作大段骨缺损动物模型。A、B、C组分别于骨缺损处植入组织工程骨膜、DPB和组织工程骨膜/DPB复合体,D组骨缺损旷置。术后4、8、12周各组随机取4只动物行X线片观察并评分；X线摄片后耳缘静脉空气栓塞处死动物,取骨缺损区标本行HE及Masson染色观察。结果(1)分离得到的原代兔骨髓间充质干细胞接种3天后细胞形态呈梭形,短棒形,月牙形及不规则形,7-9天后细胞呈单层生长铺满培养瓶底。传代培养2-3天后细胞即可铺满培养瓶底,形态呈长梭形,鱼群状排列；成骨诱导培养第8天细胞体积变大,形态由长梭形变为三角形、矮方形及多边形,约12天时细胞间逐渐出现散在的、较多的高折光性类圆形团块,团块周围细胞呈放射状密集分布；成骨诱导第14天时钙钴法碱性磷酸酶染色见细胞胞质中可见浅棕色至棕黑色的细小颗粒；茜素红染色可见紫红色钙结节,细胞质亦被染成紫红色。(2)DPB呈白色,质硬脆,髓腔内中空；SIS呈白色,薄膜状,厚度约100u m；构建的组织工程骨膜质地柔软,韧性好,外形与生理骨膜相似；扫描电镜观察示构建的组织工程骨膜上黏附大量细胞。(3)X线片检查示术后各时间段A、C组新生骨组织量明显多于B、D组。术后各时间点A、C组X线片评分显著高于B、D组,A组高于C组,差异均有统计学意义(P<0.05)。组织学观察示A组：术后4周骨缺损处有长柱状新生骨形成,并与截骨断端骨性融合,密度与正常骨相近；8周时新生骨量增多,并可见不规则骨髓腔；12周时骨髓腔已贯通。B组：术后4周可见植入的DPB,植入前DPB上所打的小孔清晰可见；8周两截骨端变钝,有少许延长,并可见DPB降解迹象；术后12周仍可见植入的DPB,与术后8周相比降解不明显。C组：术后4周有新生骨组织包被DPB, DPB上的小孔已模糊；术后8周已不见小孔,植入的组织工程骨膜/DPB复合体与截骨端有部分骨性融合；12周时植入的组织工程骨膜/DPB复合体与截骨端骨性融合,未见明显的植入物DPB,新生骨可见串珠状连续不规则骨髓腔。D组至12周时两截骨端有少许骨性延长,骨缺损处无成骨征象,密度同周围软组影。结论(1)使用密度梯度离心法可成功获得大量高纯度BMSCs,体外培养环境下,BMSCs可定向诱导为成骨细胞。(2)SIS是一种较为理想的组织工程膜状支架材料。成骨诱导后的骨髓间充质干细胞可黏附于SIS上生长。体外复合构建组织工程骨膜切实可行。(3)以SIS和成骨诱导后的BMSCs构建的组织工程骨膜可修复兔桡骨大段骨缺损。DPB不能对组织工程骨膜成骨起到理想的支架作用,组织工程骨膜辅助支架材料有待进一步探索。