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木薯块根富含淀粉,并且淀粉积累量与其块根蔗糖含量相关,转化酶(Invertase)是蔗糖分解代谢过程中的关键酶,催化蔗糖不可逆的分解为葡萄糖和果糖。本实验室前期研究碱性/中性转化酶基因的表达分析结果发现:碱性/中性转化酶基因MeNINV1(属于α组,位于质体)在各时期的表达量均远高于其他成员,这表明它是木薯块根蔗糖分解代谢的关键基因。对碱性/中性转化酶MeNINV1的功能进行深入研究,将有利于我们对碱性/中性转化酶调控木薯块根蔗糖代谢机制解析,为培育高产、高淀粉的木薯品种提供理论依据。目前,β组碱性/中性转化酶的酶活性调节机制已初步解析:AtCINV1蛋白的C末端具有14-3-3蛋白结合区域,钙依赖蛋白激酶基因家族成员CPK3和CPK21可以与14-3-3蛋白协同起作用,磷酸化该区域上的丝氨酸残基,正调控AtCINV1蛋白的活性;但磷脂酰肌醇磷酸激酶(PIP5K)家族的一个成员PIP5K9会干扰14-3-3蛋白与AtCINV1蛋白的互作,对AtCINV1活性起负调控作用。α组的碱性/中性转化酶的C末端不具有14-3-3蛋白的结合区域,它们的酶活性调节机制并不清楚。因此,我们选择MeNINV1(α组)进行深入研究,利用酵母双杂交技术和双分子荧光互补技术筛选验证与MeNINV1互作的蛋白;并对验证成功的互作蛋白进行亚细胞定位;另外,利用qRT-PCR对该蛋白的互作蛋白编码基因在转录水平的表达量进行相对定量分析,分析它们在木薯不同组织和胁迫下的表达模式。主要研究结果如下:1、MeNINV1与Me14-3-3蛋白点对点互作验证:本研究成功构建了 pGBKT7-MeNINV1诱饵载体,转化酵母AH109菌株并进行酵母毒性以及自激活检测实验,验证诱饵蛋白(MeNINV1)对酵母没有毒性并且不存在自激活,可继续进行互做验证。将基因编号:Manes 18G060900的Me14-3-3基因构建在pGADT7载体上,将其转化到含有诱饵质粒pGBKT7-MeNINV1的AH109菌株内,通过营养缺陷培养基筛选,表明MeNINV1的酶活性不受Me14-3-3蛋白调节。2、酵母双杂筛选木薯MeNINV1的互作蛋白:将pGBKT7-MeNINV1诱饵载体与酵母双杂交文库质粒共转化酵母AH109菌株进行文库筛选。在SD/-Trp-Leu缺陷型平板筛选获得44个初始阳性克隆,利用四缺板SD/-Trp-Leu-His-Ade和β-半乳糖苷酶活性检测,最终选择14个菌落为候选阳性克隆。3、酵母细胞内的MeNINV1互作蛋白筛选结果验证:本实验克隆了 9个阳性蛋白编码基因的CDS全长序列,构建了 pGADT7-CSN5B、pGADT7-CSN5A、pGADT7-Pti5、pGADT7-Cox11、pGADT7-UP1、pGADT7-PHOS34、pGADT7-FKBP20-1、pGADT7-BFN1、pGADT7-MBD4 载体,并分别与 pGBKT7 和pGBKT7-MeNINV1共转酵母AH109菌株内进行互作验证。酵母细胞内的相互作用验证结果表明,MeNINV1与CSN5B蛋白在酵母细胞内存在相互作用。4、利用双分子荧光互补技术验证MeNINV1互作蛋白的筛选结果:将诱饵蛋白(MeNINV1)与互作蛋白(CSN5B)分别与黄色荧光蛋白pSAT4-nEYFP-N1和pSAT4-cEYFP-N1BiFC表达载体片段融合,构建双分子荧光载体MeNINV1-nEYFP、CSN5B-cEYFP,采用PEG-CaC12法将载体质粒DNA转化到烟草原生质体中,25℃弱光下过夜放置后,在激光共聚焦显微镜下观察荧光。烟草原生质体表达实验结果表明,MeNINVI与CSN5B在植物活体细胞中存在相互作用。5、MeNINV1互作蛋白CSN5B的亚细胞定位:将CSN5B与pCAMBIA1300-GFP植物定位载体融合,构建荧光定位载体pCAMBIA1300-CSN5B-GFP,并采用PEG-CaC12法将载体质粒DNA转化到烟草原生质体中,在激光共聚焦显微镜下观察荧光,实验结果表明,CSN5B主要定位于烟草细胞的细胞质。6、CSN5B基因的表达特征分析:利用qRT-PCR对CSN5B基因在在木薯不同组织及在胁迫下的的表达特征进行了分析。实验结果表明CSN5B基因在木薯各部分中均有表达,但是在膨大期的块根内表达量最高,在茎的表达量最低。研究茉莉酸甲酯(MeJA)、赤霉素(GA)、脱落酸(ABA)、生长素(IAA)、水杨酸(SA)5种激素诱导CSN5B基因的表达模式,结果表明CSN5B基因的表达受激素诱导调控;处理后CSN5B在块根、茎表达量显著降低；叶片中表达量呈现出先降低后上升的趋势。