目的通过改良体外分离培养、扩增、鉴定大鼠毛囊干细胞（rHFSCs）的方法;探讨大鼠毛囊干细胞与人来源脱细胞羊膜的组织相容性;并进一步研究大鼠毛囊干细胞修复裸鼠全层皮肤的能力,为毛囊干细胞修复人皮肤缺损的临床应用研究提供实验基础与理论依据。方法无菌条件下切取5-7天SD大鼠触须部皮肤,用Dispase酶和I型胶原酶以1:1混合消化,体视显微镜下快速分离生长期毛囊隆突部,采用两步加液组织块贴壁法培养rHFSCs,胰酶消化法传代,用Ⅳ型胶原差速贴壁法纯化。通过观察贴壁细胞的形态,取不同代数纯化后的细胞检测细胞增殖能力和活力;细胞免疫荧光双标染色以及流式细胞仪等方法联合鉴定毛囊干细胞。采用物理和化学方法制作人来源脱细胞羊膜,并用钴60消毒,中长期保存脱细胞羊膜。取一定浓度的毛囊干细胞种植在脱细胞羊膜上,通过光镜、电镜观察细胞在脱细胞羊膜的粘附力,评估毛囊干细胞与人脱细胞羊膜（Human Acellular Amniotic Membrane HAAM）的组织相容性。取32只6周龄裸鼠,按照随机数字表法分为4组:A组（空白组）、B 组（rHFSCs）、C 组（HAAM）和 D 组（rHFSCs+HAAM）。4组中每组都包括不同创面面积的全层皮肤缺损的裸鼠,采用EdU标记毛囊干细胞,设空白组、rHFSCs组、空载脱细胞羊膜组、rHFSCs+脱细胞羊膜组,分别设定在7、14、21天四个时间点从大体、组织学观察裸鼠创面的修复情况。观察指标有:从大体上观察创面的渗出率、血肿程度、创面的愈合率;行HE染色,利用血管内皮细胞标记物CD31和EdU细胞追踪免疫荧光法综合评价毛囊干细胞对裸鼠皮肤缺损的修复能力。结果分离、培养、纯化的rHFSCs克隆能力好,活力强,生长曲线呈S型。免疫荧光染色以及流式细胞仪鉴定显示α6整合素,CK15、p63、SOX9呈高表达;人来源羊膜经物理和EDTA法脱细胞后,约10%～20%人体细胞残留在羊膜上,体外扩增的rHFSCs与人来源脱细胞羊膜共培养后,利用HE染色、电镜扫描结果显示:以5×106/ml的细胞接种浓度接种在脱细胞羊膜上,rHFSCs能在HAAM上很好的粘附与生长;在体内修复裸鼠皮肤缺损的实验中,使用EdU标记培养24h后,在荧光显微镜下观察到约90%的rHFSCs被标记上,该结果显示此时大部分的rHFSCs正处于细胞增殖阶段,在裸鼠移植实验第7天时,在同创面,同一时间,不同实验组之间,可以观察到:空白组、rHFSCs组、空载HAAM组、rHFSCs+HAAM组,其愈合率分别为:空白组21.9%±0.24、rHFSCs组22.5%±0.32、空载 HAAM 组 23.7%±0.14、rHFSCs+HAAM 组 24.2%±0.21,四组之间没有统计学差异（p＞0.05,n=8）。移植7天后,空载HAAM组和rHFSCs+HAAM组的表皮成活并向外扩展,表面湿润,而空白组创面则形成干痂,四组都能观察到有不同程度的红色肉芽组织增生;在移植第14天,其愈合率分别为:空白组 70.9%±0.15、rHFSCs 组 76.5%±0.23、空载 HAAM 组 79.7%±0.17、rHFSCs+HAAM组84.2%±0.31;统计学差异明显（p＜0.05,n=8）此时新生表皮逐渐增厚,表面干燥,创缘残余少许创面,而空白组创面以收缩愈合为主,中心残余创面。rHFSCs组、空载HAAM组、rHFSCs+HAAM组三组创面收缩情况要轻于对照组;在第21天,其愈合率分别为:空白组87.9%±0.24、rHFSCs组92.5%±0.12、空载 HAAM 组 94.7%±0.18、rHFSCs+HAAM 组 97.1%±0.27 统计学差异明显（p＜0.05,n=8）;四组创面都接近愈合,其中rHFSCs+HAAM组的新生表皮接近正常皮肤,较正常皮肤薄,质软,表面平整光滑,创面轻微收缩。行HE染色和CD31免疫组化染色,移植1周后的创面HE染色与CD31免疫组化显示rHFSCs组、空载HAAM组、rHFSCs+HAAM组三组的新生的血管较空白组多,基底层细胞数目多,大量成纤维细胞和新生毛细血管进入其中;移植2周和3周后的四个创面都有不同程度的血管增生,同时观察到有类似毛囊的结构形成,该结构在四组的形成数目上,以及形态上都有所差异,空白组只有少量的类毛囊组织形成,而rHFSCs组、空载HAAM组、rHFSCs+HAAM组形成的类毛囊组织能观察到一部分来自宿主的表皮干细胞以及毛囊干细胞形成长球状的毛乳头,其位置位于真皮层。特别是rHFSCs+HAAM组形成的类毛囊组织,形成的数量最多。表明了体外扩增的毛囊干细胞与HAAM复合的移植物在体内微环境的引导下能促进新生血管以及皮肤附属器官的形成;为了能较直观的表明,体外扩增的rHFSCs在体内促进血管新生以及rHFSCs增殖、迁移的部位,经过对rHFSCs组和rHFSCs+HAAM组在2周后、3周后收取创面样本行CD31（红色）免疫荧光染色,以及EdU细胞追踪显色,结果显示:被EdU标记上的细胞显绿色,红色管状结构为新生血管。移植2周后,真皮层中新生的血管数量逐步增多,部分位于类毛囊组织周围红色官腔内有绿色显影,说明有毛囊干细胞在体内微坏境诱导下参与新生血管的形成。移植3周后,真皮层中新生的血管数量显著增加。然而EdU标记上的rHFSCs主要存在与类毛囊组织中;直观的说明了体外扩增的毛囊干细胞在体内的迁移与皮肤附属器官的形成中,主要是参与类毛囊组织的形成以及部分临近类毛囊组织的血管形成。结论建立了一套较为成熟的rHFSCs分离培养高效技术体系,证实了其的增殖能力;确定体外毛囊干细胞在羊膜上的接种密度,采用物理法与化学方法制作得到的脱细胞羊膜与rHFSCs共培养后,证实了脱细胞羊膜有很好的生物相容性;rHFSCs-HAAM复合物更能加快创面的愈合,为新型组织工程皮肤、细胞移植治疗皮肤缺损等疾病等提供理想的种子细胞以及理想的天然皮肤替代物。