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强直性脊柱炎(Ankylosing Spondylitis,AS)是一种常见的自身免疫性疾病,以骶髂关节和中轴脊柱关节炎症为特点,可导致关节功能障碍甚至功能丧失,严重影响了患者正常的工作和生活。AS发病机制尚不明确,95%的患者呈现HLA-B27阳性。然而全基因组关联研究(Genome-wide association studies,GWAS)结果显示有更多的遗传因素参与AS发病。人类基因组中绝大多数序列不能编码蛋白质,这些非编码序列在机体各项生命活动中同样发挥了重要作用。环状RNA(circular RNA,circRNA)作为一种具有特殊环状结构的非编码RNA,自身具有稳定性、保守型、组织发育特异性,在人类多种疾病的发生发展中发挥重要作用,是潜在的诊断标志物和治疗靶点,但是目前仍缺乏AS中circRNA表达谱相关研究。T细胞与AS发病密切相关,通过分泌多种炎症因子如TNF-α、IL-17、IL-23或者提高自身反应性促进疾病进展,近年来的研究主要集中在分泌IL-17的Th17细胞,有研究显示Th17细胞呈记忆性表型,可能驻留于记忆性T细胞池中,而AS中记忆性CD4+T细胞的相关研究较少,因此本研究通过建立AS记忆性CD4+T细胞中circRNA表达谱,验证差异表达的circRNA,并进一步探索circRNA在细胞中的功能及是否参与AS发病机制。第一章强直性脊柱炎记忆性CD4+T细胞circRNA表达谱及生物信息学分析目的:建立AS记忆性CD4+T细胞中circRNA表达谱,预测差异表达的circRNA相关的mRNA在细胞中的功能,为下一步研究circRNA的作用及作用机制奠定基础。方法:密度梯度离心法分离5名初发未治AS患者与5名健康对照者的外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cells,PBMC),分选记忆性 CD4+T 细胞,通过高通量测序建立circRNA表达谱,筛选差异表达的circRNA,在验证队列中利用real-time PCR验证测序结果。对差异表达的circRNA进行生物信息分析,预测其潜在的靶向miRNA和mRNA,并对相关mRNA进行KEGG和GO分析,推测差异表达的circRNA可能发挥的生物学功能。同时利用受试者工作特征(Receiver operating characteristic,ROC)曲线分析差异表达的circRNA是否具有诊断价值。结果:在10个样本中共检测到10,808个circRNA,其中357个表达上调,278个表达下调,PCR验证结果显示circPDE5A,circCCNY,circRASA1在AS中显著升高。生物信息预测发现circPDE5A、circRASA1和circCCNY可能靶向miRNA256个,mRNA6,989个。相关mRNAKEGG分析和GO分析结果显示差异表达的circRNA可能通过Akt、MAPK、Wnt、自噬等信号通路参与细胞代谢、基因表达调控等生物学过程。ROC曲线分析发现circPDE5A、circRASA1和circCCNY曲线下面积分别为0.7850、0.7652、0.7565,具有统计学意义。结论:AS患者与健康对照组记忆性CD4+T细胞的circRNA表达谱存在差异,差异表达的circRNA是AS潜在的诊断标志物,且可能通过调控多种信号通路参与AS发病机制。第二章circRNA-miRNA-mRNA通路构建及功能研究目的:构建circRNA-miRNA-mRNA通路,探索该通路在细胞中的功能。方法:利用circBase数据库获取circRASA1和circCCNY的序列信息,对PCR产物进行Sanger测序验证序列特异性。RNase R处理RNA样品后进行PCR反应,对产物进行琼脂糖凝胶电泳,检测circRNA的稳定性。双荧光素酶报告基因验证circRASA1和circCCNY与miR-181 a/b/c/d-5p的结合。Jurkat细胞转染慢病毒建立circRASA1和circCCNY低表达稳转细胞系,通过real-time PCR和Western blot检测miR181c-5p 及 PKC-δ 的表达水平。同时转染 miR181c-5p mimic 过表达 miR181c-5p检测PKC-δ的表达水平。KEGG分析PKC-δ的相关通路,在上述模型中通过real-time PCR和Western blot检测自噬相关基因的表达。结果:Sanger测序验证了 circRASA1、circCCNY的PCR扩增片段中包含反式剪接位点。RNaseR处理样品后内参分子GAPDH显著降解,而circRASA1、circCCNY则相对稳定。双荧光素酶实验表明circRASA1、circCCNY与miR-181c-5p具有更牢固的结合力,且AS患者记忆性CD4+T细胞中miR-181c-5p表达水平显著降低,干扰circRASA1、circCCNY的表达可上调miR-181c-5p的表达,同时下调PKC-δ的mRNA与蛋白水平,过表达miR-181c-5p可同样下调PKC-δ的蛋白表达。KEGG分析显示PKC-δ参与自噬相关通路,干扰circRASA1、circCCNY的表达可下调自噬相关基因ATG5和ATG7的mRNA与蛋白水平和LC3B-II蛋白表达,过表达miR-181c-5p可同样降低ATG5、ATG7与LC3B-II的蛋白表达。结论:circRASA1、circCCNY可与PKC-δ竞争性结合miR-181c-5p,调控细胞中自噬相关基因的表达,改变了细胞自噬水平,可能与细胞自身反应性有关,进而参与AS发病机制。