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肺癌是一种常见恶性肿瘤,占全球男性发病率和死亡率的首位,女性发病率第四位,死亡率的第二位,严重威胁人类健康。现有肺癌的治疗手段包括手术治疗、铂类为基础的化疗、放疗以及靶向治疗,尽管在过去的十年中肺癌的治疗有了长足的进步,但由于肺癌早期容易出现转移,因此在中国有近78%的非小细胞肺癌患者诊断时为III-IV期,而这部分患者的5年生存率较低,因此肺癌的高转移率是导致其高死亡率的主要因素之一。深入了解肺癌转移的分子机制对于预防晚期肺癌,提高肺癌生存率有着不可忽略的重要意义。在肺癌的发生发展过程中,癌细胞的染色体和基因组极不稳定,可发生复制、丢失、转位、突变等变化,从而引起某些基因发生结构、表达和功能上的改变,其中最重要的变化是癌基因的激活和抑癌基因的失活。近年来,抑癌基因LKB1在NSCLC的恶性进展和转移中的作用正在引起肿瘤学家们越来越多的关注。LKB1(Liver Kinase B1),又称STK11(serine/theronine protein kinase 11),具有丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶活性。在多数散发性的肿瘤中,LKB1的突变是罕见的,但在NSCLC中,LKB1突变率可高达20%~30%,位于第三位。LKB1通过作用下游激酶在调节细胞能量代谢、细胞生长和细胞极性等方面发挥重要作用。AMPK(AMP-regulated protein kinase)是LKB1下游重要的靶蛋白之一,在调节细胞能量代谢方面起着重要作用。此外,LKB1还可以激活其他AMPK相关的激酶,如MARKs(microtuble affinity-regulating kinases),MARKs通过参与微管稳定性的调节影响细胞的极性。LKB1在肺癌转移中扮演着相当重要的角色。在Kras突变活化的小鼠肺癌模型中LKB1的缺失显著促进肺部肿瘤的淋巴结和远处转移;而且,LKB1突变导致肿瘤更短的潜伏期以及更高的转移倾向性。我们在一系列NSCLC细胞系中检测了LKB1的表达,选取了LKB1野生型的细胞系H1299,利用Lenti-virus载体系统建立了可稳定表达LKB1sh RNA的H1299同源非小细胞肺癌细胞系H1299-LKB1sh RNA,并从m RNA和蛋白水平验证了LKB1的knockdown效果。Transwell实验结果表明,与对照组(H1299-p LKO.1)相比,LKB1 knockdown后,H1299细胞的侵袭能力增强。目前,LKB1抑制肺癌转移的分子机理还知之甚少。文献表明,无论抑制NEDD9、LOX还是SRC,只能部分逆转LKB1缺失导致的肺癌的转移,效果非常有限,因此我们推测,可能还有其他的分子或者信号通路在该过程中扮演着重要的角色。为了深入研究LKB1抑制肺癌侵袭和转移的分子机理,我们在前期研究中利用基因表达谱芯片技术比较了上述H1299-p LKO.1和H1299-LKB1sh RNA细胞系中的差异表达基因,发现了一系列与肿瘤侵袭和转移相关的重要分子,其中基质金属蛋白酶1(Matrix Metalloproteinase-1,MMP1)引起了我们极大的兴趣。首先,LKB1 knockdown后MMP1的m RNA水平显著升高,比对照组大约高5倍左右;其次,文献表明,MMP1是MMP家族成员之一,又称为胶原酶,可以降解ECM中的蛋白成分,破坏肿瘤细胞侵袭的组织学屏障,在肿瘤侵袭转移中起关键性作用。在众多的实体肿瘤例如:直肠癌、胃癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、甲状腺癌和脑肿瘤中均证实MMP的表达与肿瘤的侵袭转移的密切关系。因此,我们选择MMP1作为LKB1下游重要的靶分子进行探讨。在本论文中,我们用Real-time PCR和Western Blot进行了验证,观察到与芯片一致的结果,即LKB1缺失导致MMP1的m RNA水平升高、蛋白水平也相应升高;此外,我们还发现,在LKB1突变的NSCLC细胞系中过表达LKB1可以抑制MMP1的水平。而且,在肺癌标本中,LKB1的水平与MMP1呈负相关。以上结果表明,LKB1可以负调控MMP1的表达。LKB1可能通过对MMP1的负调控,降低MMP1的表达水平,从而抑制非小细胞肺癌细胞的侵袭。MARK是LKB1下游的重要激酶之一。我们发现,加入MARK的小分子抑制剂,可以上调ERK的磷酸化水平、促进MMP1的表达水平,提示MARK可能在LKB1下游介导MMP1的负调控。总之,本文在前期研究基础上,利用分子生物学和体外细胞学实验证实,LKB1缺失导致肺癌细胞侵袭能力增强,LKB1负调控MMP1的表达,MARK作为下游的重要分子介导LKB1对MMP1的负调控。这些工作将在很大程度上提高我们对于LKB1作为抑癌基因在肺癌转移中的认识,并为将来肺癌的分子靶向治疗提供新的思路。