霍乱弧菌是一种人类肠道急性腹泻疾病霍乱的病原菌,感染霍乱严重者体液的快速流失会导致脱水、休克甚至死亡。在霍乱弧菌毒素调控网络系统中,有一个重要的毒素调控蛋白TcpP,TcpP是一个跨细胞内膜蛋白,有三个不同的结构域:N端的细胞内DNA结合结构域,一个跨膜区和一个C端细胞周质结构域。前期研究发现,霍乱弧菌DsbA在牛磺胆汁酸盐存在的条件下,通过诱导周质空间C207和C218形成分子间二硫键,而使调控蛋白TcpP形成更多的二聚体,TcpP蛋白以二聚体的形式激活下游毒素基因toxT的表达。我们研究发现TcpP第58位半胱氨酸残基突变为丝氨酸(TcpPC58S)后不能够形成二聚体也不能够激活毒素基因的表达,TcpP胞内结构域四个半胱氨酸残基的功能尚不清楚。因此,本文主要对TcpP胞内结构域半胱氨酸残基的功能及其在TcpP二聚体形成中的作用进行研究。通过定点突变的方法,将这四个半胱氨酸残基分别突变为丝氨酸残基后发现,第58位的半胱氨酸残基突变后,TcpPC58S不能激活下游毒素基因的表达。Western blot分析发现,TcpPC58S仍然能结合到细胞内膜上,其蛋白稳定性与野生型相似。这表明C58的突变并没有对TcpP蛋白的折叠产生重要的影响。然而,应用大肠杆菌双杂交技术以及膜蛋白纯化分析均发现,尽管在有胆汁酸盐存在的条件下,TcpPC58S也不能形成二聚体。前期研究表明,TcpPC218S在不加胆盐诱导的情况下也能够激活toxT的表达,我们研究发现TcpPC58/218S没有形成二聚体,也不能够激活毒素基因的表达,说明TcpP第218位半胱氨酸也不能够恢复TcpPC58S的活性及二聚体的形成。同时,TcpPC58S胞内结构域与ToxR的周质跨膜区融合表达也不能形成二聚体。这说明第58位的半胱氨酸残基对于TcpP二聚体的形成具有重要的作用,同时也进一步证明TcpP是以二聚体的形式与下游调控基因的启动子结合,从而激活下游基因的表达。半胱氨酸残基之间二硫键的形成对于蛋白的折叠和功能十分重要,为了进一步研究TcpP激活毒素基因的表达是否需要在C58之间形成二硫键,同时我们为了避免TcpP周质空间中半胱氨酸的影响,利用TcpPC207/218S进行胞内结构域二硫键的分析,发现在TcpPC207/218S单体分子内没有二硫键的形成。将TcpP胞内结构域与ToxR的周质跨膜区融合表达组成嵌合蛋白(CP-TR-PRC236/294S),结果表明嵌合蛋白能够形成二聚体并激活毒素基因的表达。利用这个嵌体蛋白研究发现CP-TR-PR C236/294S突变体没有二硫键的形成,表明了 TcpP二聚体的形成不需要胞内结构域半胱氨酸形成分子间的二硫键。为了更好地研究TcpP第58位的半胱氨酸残基的功能,我们构建了 TcpPC58A、TcpPC58T、TcpPC58L和TcpPC58G突变株后发现,TcpPC58L和TcpPC58G丧失了活性,而TcpPC58A和TcpPC58T仍然能够激活下游毒力基因的表达。因此,尽管TcpP二聚体的形成不需要胞内结构域形成分子内或分子间的二硫键,但第58位半胱氨酸残基对于TcpP结合下游调控基因的启动子却十分重要。为了研究是否仅有第58位半胱氨酸便足以使TcpP激活下游毒素基因的表达,我们构建了 TcpPC19/51/124S突变体,研究发现TcpPC19/51/124S激活下游毒力基因的表达与TcpPWT相似,霍乱弧菌乳鼠定殖实验发现TcpPC19/51/124S与野生型具有相似的定殖能力,而TcpPC58S却几乎不能在乳鼠肠道中定殖。然而,在成鼠的定殖模型中,TcpPC19/51/124S的定殖能力反而较野生型要弱,而TcpPC58S却具有比野生型还要强的定殖能力。这些结果表明TcpP胞内结构域的四个半胱氨酸残基中,仅需要第58位的半胱氨酸残基便足以使得TcpP蛋白具有激活下游毒力基因表达的活性,然而,另外的三个半胱氨酸残基在霍乱弧菌处于不同的生长环境中发挥不同的生理功能。综上所述,本研究证明了 TcpP第58位半胱氨酸残基对于TcpP二聚体的形成以及激活下游毒素基因的表达必不可少,且TcpP胞内结构域仅第58位半胱氨酸便足以激活毒力基因的表达;TcpP二聚体的形成不需要胞内结构域半胱氨酸残基形成分子间或分子内的二硫键。TcpP胞内结构域的半胱氨酸残基对于TcpP激活下游毒力基因的表达以及对于适应不同生存环境进行基因的表达调控具有重要的作用。本研究为霍乱弧菌毒素基因调控机制的研究提供了理论基础。