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第一部分基因芯片技术检测和筛选小鼠腹腔巨噬细胞M1和M2亚型的表达基因：M1高表达双调蛋白 目的：筛选并确认M1和M2型巨噬细胞表达差异较大的目的基因。 方法：提取C57BL/6J小鼠腹腔巨噬细胞（PM），分别用脂多糖（LPS，100ng/ml）和IL-4（20ng/ml）刺激4h诱导M1和M2亚型，使用基因芯片检测M1和M2的基因表达谱，选择在M1和M2中表达差异较大的目的基因。建立PM的M1到M2阶梯极化模型和其它类型巨噬细胞包括肺泡巨噬细胞（AM）和RAW264.7细胞的M1和M2极化模型，使用实时逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）和酶联免疫吸附试验(ELISA)验证目的基因表达。用目的基因的重组蛋白或蛋白中和抗体预处理腹腔巨噬细胞30min后再用LPS刺激24h，ELISA检测细胞上清中TNF-α、IL-6和GM-CSF的浓度。Western Blot检测目的基因的蛋白受体在PM、AM和RAW264.7细胞中的表达。 结果：基因芯片结果显示双调蛋白（Areg）是PM的M1亚型中基因表达量最高的上皮生长因子受体（EGFR）的配体。qRT-PCR和 ELISA证实了 Areg在 PM、AM和RAW264.7细胞的M1中高水平表达但在 M2中不表达或微量表达。PM、AM和RAW264.7细胞不表达EGFR，重组小鼠Areg和Areg中和抗体均不影响M1型PM分泌TNF-α、IL-6和GM-CSF。 结论：M1型巨噬细胞大量表达Areg但不表达其受体EGFR，Areg不影响M1型巨噬细胞分泌炎症因子。 第二部分脂多糖诱导的小鼠急性肺损伤模型中肺泡巨噬细胞分泌双调蛋白 目的：研究脂多糖（LPS）诱导的急性肺损伤（ALI）小鼠肺组织中双调蛋白（Areg）的表达水平和来源。 方法： C57BL/6J小鼠气管滴注LPS（3mg/kg）诱导ALI，3、6、12和24h后收集肺组织和肺泡灌洗液（BALF），酶联免疫吸附试验（ELISA）检测肺组织匀浆和BALF中双调蛋白（Areg）的浓度，石蜡切片免疫荧光双标检测肺组织Areg和Iba-1的共表达情况。LPS诱导ALI2h后提取肺泡巨噬细胞（AM）用实时逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）检测 Areg的基因表达。脂质体包裹的氯膦酸盐（Clod）气管滴注48h后建立LPS诱导ALI模型，6h提取BALF用ELISA检测Areg浓度。相同数量的AM和肺泡上皮细胞系MLE12细胞在0.1、1和10μg/ml的LPS中培养24h，或在1μg/ml的LPS中培养3、6、12和24h，用ELISA检测细胞上清中Areg的浓度。 结果：Areg在LPS诱导ALI小鼠的肺组织和BALF中显著表达，6h达到高峰。免疫荧光结果显示Areg和巨噬细胞的标志物Iba-1共表达。Areg的mRNA水平在LPS诱导ALI2h后的AM中显著升高。Clod去除肺泡巨噬细胞后，LPS诱导ALI小鼠的BALF中Areg浓度明显降低。LPS刺激Areg在AM中的表达具有浓度依赖性和时间依赖性。MLE12细胞在LPS刺激下不分泌Areg。 结论：Areg在LPS诱导ALI小鼠的肺组织中大量表达，主要来源于肺泡巨噬细胞。 第三部分双调蛋白减轻脂多糖诱导的小鼠急性肺损伤 目的：研究内源性和外源性双调蛋白（Areg）对脂多糖（LPS）诱导小鼠急性肺损伤（ALI）的影响。 方法：C57BL/6J小鼠腹腔注射 IgG（50μg/只）或 Areg中和抗体（Anti-Areg，50μg/只），30min后气管内滴定1mg/kg LPS诱导ALI；或腹腔注射PBS（0.25ml/只）或重组小鼠Areg（rmAreg，5μg/只），30min后气管内滴定3mg/kg LPS。气管内滴定2ml/kg PBS作为对照。24h后计数肺泡灌洗液（BALF）中总细胞，流式细胞仪分析BALF中Ly6G+细胞比例，光学显微镜观察肺组织形态变化行肺损伤评分，BCA法检测BALF中总蛋白量，ELISA测定BALF中TNF-α、IL-6和IgM浓度。MLE12细胞用100μg/ml的LPS刺激24h诱导凋亡，或先用rmAreg（1、10和50ng/ml）处理30min再用LPS刺激。1μg/ml LPS刺激肺泡巨噬细胞（AM）24h，培养液（LPS-CM）用IgG（5μg/ml）或 Anti-Areg（5μg/ml）预处理3h后干预 MLE12细胞，30min后用 LPS（100μg/ml）诱导凋亡。3mg/kg LPS刺激ALI小鼠6h，BALF（LPS-BALF）用IgG（5μg/ml）或 Anti-Areg（5μg/ml）预处理3h后干预 MLE12细胞，30min后用 LPS（100μg/ml）诱导凋亡。Annexin-Ⅴ和PI试剂盒检测凋亡。 结果：在1mg/kg LPS诱导的ALI小鼠中，与IgG预处理相比，Anti-Areg预处理加重ALI肺组织病理变化，增加BALF中总细胞数、中性粒细胞数、TNF-a、IL-6、总蛋白和IgM浓度。在3mg/kg LPS诱导的ALI小鼠中，与PBS预处理相比，Areg预处理减轻ALI肺组织病理变化，减少BALF中总细胞数、中性粒细胞数、TNF-a、IL-6、总蛋白和IgM浓度。rmAreg（10和50ng/ml）预处理减少LPS诱导的MLE12细胞凋亡。Anti-Areg较 IgG预处理增加 LPS-CM对 LPS的促凋亡作用。IgG预处理的LPS-BALF增加LPS诱导的MLE12细胞凋亡，与之相比Anti-Areg预处理的LPS-BALF和LPS共同刺激诱导的凋亡更显著。 结论：LPS诱导小鼠肺组织中表达的Areg抑制ALI，肺泡巨噬细胞分泌的Areg对肺泡上皮细胞有直接的保护作用。 第四部分双调蛋白对脂多糖诱导小鼠急性肺损伤EGFR和AKT信号通路的影响 目的：研究双调蛋白（Areg）对脂多糖（LPS）诱导的小鼠ALI的保护作用是否通过激活上皮生长因子受体（EGFR）和AKT蛋白激酶信号通路实现，以探讨Areg减轻LPS诱导小鼠ALI的反应机制。 方法：C57BL/6J小鼠腹腔注射 IgG（50μg/只）或 Areg中和抗体（Anti-Areg，50μg/只），30min后气管内滴定1mg/kg LPS诱导ALI；或腹腔注射PBS或重组小鼠Areg（rmAreg，5μg/只），30min后气管内滴定3mg/kg LPS。气管内滴定2ml/kg PBS作为对照。LPS或PBS处理6h后收集右上肺组织。MLE12细胞用rmAreg（50ng/ml）处理5、10和30min，或用LPS（10μg/ml）处理5、10、30和60min，或用rmAreg和LPS共同刺激5和10min，或用PBS处理作为对照。1μg/ml LPS刺激肺泡巨噬细胞（AM）24h，培养液（LPS-CM）用 IgG（5μg/ml）或 Anti-Areg（5μg/ml）预处理3h后干预MLE12细胞10min。3mg/kg LPS刺激ALI小鼠6h，BALF（LPS-BALF）用IgG（5μg/ml）或Anti-Areg（5μg/ml）预处理3h后干预MLE12细胞10min。提取肺组织和MLE12细胞蛋白，Western Blot检测EGFR、p-EGFR、AKT和p-AKT的表达。 结果：在1mg/kg LPS诱导的ALI小鼠中，与IgG预处理相比，Anti-Areg预处理不改变肺组织EGFR和AKT水平，但减少p-EGFR和p-AKT的表达。在3mg/kg LPS诱导的ALI小鼠中，与PBS预处理相比，rmAreg预处理不改变肺组织EGFR和AKT水平，但增加p-EGFR和p-AKT的表达。在MLE12细胞中，rmAreg处理增加p-EGFR和p-AKT表达，LPS刺激不影响p-EGFR和p-AKT水平，rmAreg和LPS共刺激增加p-EGFR和p-AKT的表达。与IgG预处理相比，Anti-Areg预处理减少LPS-CM刺激的MLE12细胞中p-EGFR和p-AKT的表达，减少LPS-BALF刺激的MLE12细胞中p-EGFR和p-AKT的表达。 结论：LPS诱导小鼠ALI中表达的Areg激活肺组织的EGFR和AKT磷酸化，肺泡巨噬细胞分泌的Areg激活肺泡上皮细胞的EGFR和AKT磷酸化。