论文部分内容阅读
研究背景与研究目的：腺病毒(Adeno virus, Ad)是一种双链DNA病毒。迄今为止,人们认识的腺病毒多达57种血清型。根据不同腺病毒的血凝特性,致癌性,基因分型以及系统发生分析结果,腺病毒总共可以分为从A到G七个亚型。其中B亚型又可以根据其生物学特性以及遗传性状分为B1和B2亚群,人腺病毒35型(Ad35)属于其中的B2亚群。Ad35可以通过其C-末端三聚体纤毛突领域的残端与人细胞膜表面膜辅助蛋白(membane cofactor protein, MCP, CD46)分子结合从而感染人体细胞。单克隆抗体(monoclonal antibodies, mAbs)作为一种新兴的肿瘤治疗药物,近年来取得了快速的发展,引起了人们的广泛关注和兴趣。西妥昔单抗(Cetuximab)结构为人鼠嵌合型,其主要作用于人上皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor, EGFR)。通过与EGFR分子结合,Cetuximab能诱导产生抗体依赖的细胞介导的细胞毒效应(antibody-dependent, cell-mediated cytotoxicity, ADCC)以及补体依赖的细胞毒效应(complement-mediated cytotoxicity, CDC)来杀伤肿瘤细胞。CD46分子广泛表达在人体除红细胞以外的所有组织细胞的表面。CD46分子主要作用是在Ⅰ因子诱导的C3b、C4b补体成分的降解过程当中作为一种辅助因子。有研究指出,多种肿瘤细胞能通过上调细胞表面的CD46分子水平逃避机体补体系统的攻击,从而限制单克隆抗体的作用效果。其中,卵巢癌组织以及细胞系均能通过上调CD46分子降低Cetuximab诱导的CDC效应对其产生的杀伤作用。Ad35K++是一种突变的Ad35型纤毛突蛋白,与野生型的Ad35型纤毛突蛋白相比对CD46分子具有更强的亲和力。体外实验证明,应用Ad35K++与多种肿瘤细胞共同孵育可以引起CD46分子的降解以及胞内转移。综上所述,我们希望能通过体外实验,探讨Ad35K十+对卵巢癌细胞系表面CD46分子的作用。进而研究抑制卵巢癌表面CD46分子对Cetuximab诱导的CDC效应的增强效果。探索Ad35K++增强Cetuximab诱导的CDC效应其作用于卵巢癌细胞系的具体作用机制。研究方法：1.卵巢癌肿瘤细胞系体外正常传代培养。2.通过流式细胞术检测卵巢癌细胞系SK-OV-3以及A2780表面EGFR分子的表达水平。3.运用流式细胞术检测SK-OV-3细胞与Ad35K++共同孵育在15min、1、8、24、48h后细胞表面CD46分子表达水平。4.通过MTT比色法测定卵巢癌细胞体外增殖抑制率。5.通过流式细胞术检测卵巢癌细胞凋亡率。6. Western blotting法检测卵巢癌凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2、c-caspase3 、c-PARP的表达情况。研究结果：1.流式结果显示,SK-OV-3细胞表面EGFR平均表达水平明显高于A2780细胞。2.Ad35K++与SK-OV-3细胞共同孵育后,CD46分子表达水平明显降低,在孵育8h后CD46水平降到最低。3.Ad35K++通过增强Cetuximab诱导的CDC效应显著抑制SK-OV-3细胞增殖。4.Ad35K++增强Cetuximab诱导的CDC效应,从而引起更多细胞发生凋亡细胞凋亡比例明显上升。5.Ad35K++联合Cetuximab与NHS组相较于其他组Bax, c-caspase3以及c-PARP表达水平明显上调,Bcl-2表达水平明显下调。研究结论：Ad35K++能显著抑制卵巢癌细胞系SK-OV-3细胞表面的CD46分子水平,进而增强Cetuximab对SK-OV-3的抗肿瘤效应。体外与Ad35K++共同孵育8h后,能明显增加Cetuximab介导的CDC效应对卵巢癌细胞的增殖抑制效应。同时,单独将Ad35K++与卵巢癌细胞进行孵育并没有产生明显的增殖抑制效应,提示Ad35K++有较好的安全性。联合应用Ad35K++与Cetuximab相对于单用Cetuximab显著增加SK-OV-3细胞的凋亡比例,说明联合应用Ad35K++能使得Cetuximab诱发的CDC效应增强,诱导更多的细胞发生凋亡。联合应用Ad35K++和Cetuximab相较于单独应用Cetuximab,促凋亡蛋白Bax, c-caspase3以及c-PARP表达水平明显上升,Bcl-2表达水平明显下调。Bcl-2/Bax比例明显下降,说明联合应用Ad35K++能使得Cetuximab诱发的CDC效应增强,细胞主要通过线粒体介导的细胞凋亡途径发生凋亡。综上所述,Ad35K++能在体外状态下安全有效地增强Cetuximab对卵巢癌细胞的抑制作用。我们的实验为探索卵巢癌免疫治疗方法提供新思路。