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尖角突脐孢菌(Exserohilum monoceras)是世界恶性杂草稗草(Echinochloa crusgalli)的自然致病菌,其产生的毒素是使稗草发病的重要因素。本文旨在为开发该毒素为微生物源除草剂作基础性研究,包括它的液体发酵方法、萃取工艺、作用范围、作用机理等,并对粗毒素活性成分进行了初步分离。
通过种子萌芽测定法发现,尖角突脐孢菌DL5、G9、J32、N5、PB3、PX51和X27七种菌株经过液体发酵,都能产生毒素,以X27发酵液毒素活性最高,J32次之,其它活性较低。
选用尖角突脐孢菌X27,优化了它的液体产毒培养基,并确定了最佳毒素提取方法。X27液体发酵培养基最佳配方是:马铃薯20%,葡萄糖1.6%,玉米粉0.9%。分别用石油醚、乙酸乙酯、甲醇依次萃取X27菌株发酵液,分别得到粗毒素。生物活性测定结果表明,用乙酸乙酯萃取所得粗毒素的活性最高,萃取方法是乙酸乙酯与浓缩发酵液的体积比为2:1,共萃取3次。
X27菌株发酵得到的粗毒素在浓度为5.0 g/L时,对12种有代表性杂草种子的萌芽都有一定的抑制作用,尤其对反枝苋、牛筋草、稗草,根芽抑制率分别超过90%和70%;对7种有代表性杂草幼苗的生长都有不同程度的抑制作用。对反枝苋、稗草抑制作用较强,喷药后7天,苗高抑制率分别超过20%;28天,地上和地下部分鲜重抑制率均分别超过50%和70%。
以稗草和反枝苋为重点研究对象,测定了5.0 g/L粗毒素对它们离体叶片的活性,发现它能使稗草1-4叶期、反枝苋2-4叶期离体叶片全部枯萎;还测定了它对不同龄期幼苗的活性,结果表明,1-2叶期稗草和2-4叶期反枝苋对毒素较为敏感。选取2叶期稗草和4叶期反枝苋,测定了粗毒素对它们叶片叶绿素含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性、丙二醛(MDA)含量和电导率4项生理指标的影响,发现喷药后7天,粗毒素能显著影响这四项生理指标,使叶绿素含量下降、SOD活性升高、MDA含量上升和相对电导率增大;到第14天和28天,对这四项生理指标已无显著影响,但植株早期受到的损害不能完全恢复,形态及生物量与对照差别很大。
通过硅胶柱层析对X27粗毒素的活性组分进行分离,生测结果表明,经过5次分离后,组分5-Ⅲ活性最强,其洗脱液极性在石油醚:乙酸乙酯=2:1~石油醚:乙酸乙酯=1:1之间。5-Ⅲ浓度在0.2 g/L时对稗草根芽的生长有很强抑制作用,比分离前租毒素的药效提高了近20倍。采用气相色谱-质谱联用仪对5-Ⅲ组分进行了分析,发现它含46种物质,其中鉴定出36种,占色谱总出峰面积的94.24%。相对含量较高的共有5种,分别是十八醇、3-(2,2-二甲基丙醛肟)二环[3.3.1]壬烷.2,4-二酮、邻苯二甲酸二丁酯、十六醇和雪松醇,分别占总量的25.52%,10.54%,9.24%,7.19%,5.55%。通过对十八醇、十六醇、邻苯二甲酸二丁酯的生物活性测定,发现邻苯二甲酸二丁酯活性较强,可能是主要活性物质之一。
尖角突脐孢菌毒素作用范围广,对多种杂草萌芽、幼苗生长都有抑制作用,有开发为土壤处理或茎叶处理除草剂的潜力。它对一些作物也有不同程度的活性,需要研究相应安全剂或直接开发为灭生性除草剂。粗毒素经过适当的分离,单位活性大为提高,具有良好的开发前景。