第一部分:建立脊髓细胞凋亡的动物模型目的:选择性横断单侧坐骨神经,构建脊髓细胞凋亡的动物模型。方法:在右侧坐骨神经分叉上方切断新生大鼠的坐骨神经,用浸有无菌生理盐水(NS)的无菌止血海绵包裹坐骨神经近侧断端,建立脊髓细胞凋亡的动物模型。运用TUNEL免疫荧光、Quantitative Real-time PCR和Western blot技术对不同时间点的模型进行形态学观察。结果:1.TUNEL免疫荧光染色结果显示,坐骨神经横断6h、12h、24h、48h后脊髓细胞的凋亡数量与模型组相比差异具有统计学意义(P<0.05),且损伤24h后TUNEL阳性细胞的数量最多。2.Quantitative Real-time PCR检测结果显示,坐骨神经损伤后Caspase-3的转录水平随着时间的延长逐渐增高,且在24h达到高峰;Bax与Bcl-2的转录水平也随着损伤时间的延长而增高,Bax在12h达高峰,而Bcl-2在这个过程中只是略微增高,并于24h的转录水平呈现高峰期,其中Bcl-2/Bax的比值在12h和24h时最小。坐骨神经横断后的6h、12h、24h及48h,促凋亡基因Caspase-3与bax的表达明显增多,与假手术组相比差异有统计学意义(P<0.05)。3.Western blot结果同Quantitative Real-time PCR检测结果相同,损伤后不同时间点(6h、12h、24h、48h)Caspase-3、Bax的表达明显增高,而Bcl-2的表达只是略有增加。提示细胞凋亡模型制备成功。结论:成功建立脊髓细胞凋亡模型。第二部分:牛膝多肽对单侧坐骨神经横断后脊髓和背根神经节细胞凋亡的影响目的:检测牛膝多肽对单侧坐骨神经横断诱导的脊髓和背根神经节细胞凋亡的影响,探讨牛膝多肽在脊髓和背根神经节细胞凋亡中的作用及机制,为临床脊髓损伤的治疗提供理论基础和实验依据。方法:1.本实验以出生1d的SD大鼠为研究对象,坐骨神经横断后在近侧断端分别给予生理盐水(NS)、神经生长因子-β(NGF-β)及不同浓度的牛膝多肽(0.001mg/ml、0.01mg/ml、0.1mg/ml、1mg/ml),从而将实验对象分为假手术组、阴性对照组、阳性对照组及实验组。2.TUNEL免疫荧光技术检测腰膨大处脊髓和背根神经节细胞的凋亡情况。3.Quantitative Real-time PCR检测Caspase-3、Bcl-2、Bax的m RNA转录水平变化。4.Western blot检测Caspase-3、Bcl-2、Bax的蛋白表达水平变化。结果:1.TUNEL免疫荧光结果显示,应用牛膝多肽(0.01mg/ml、0.1mg/ml、1mg/ml)后脊髓和背根神经节细胞凋亡的数量比NS组阳性数都有减少,具有统计学意义(P<0.05)。2.Quantitative Real-time PCR检测结果表明,坐骨神经横断后给予不同浓度的牛膝多肽,Caspase-3、Bax的表达水平均有不同程度的下降,其中牛膝多肽0.1mg/ml、1mg/ml组Caspase-3、Bax的m RNA表达水平明显低于NS组,差异具有统计学意义(P<0.05),与假手术组和NGF-β组比较无统计学意义(P>0.05)。抗凋亡基因Bcl-2的表达升高,且在给予0.1mg/ml、1mg/ml的牛膝多肽时升高更显著,Bcl-2/Bax的比值变化亦是如此。3.Western blot实验结果显示,给予牛膝多肽后促凋亡蛋白Caspase-3、Bax的表达减少而抗凋亡蛋白Bcl-2的表达增加,当牛膝多肽浓度为0.1mg/ml、1mg/ml时,三个凋亡相关因子的表达在实验组与阳性对照组比较均无统计学意义(P>0.05),且分析结果表明,当牛膝多肽浓度为0.1mg/ml、1mg/ml时,Bcl-2/Bax的比值最高。结论:牛膝多肽能抑制单侧坐骨神经横断诱导的脊髓和背根神经节细胞凋亡,具有神经保护作用。这种保护作用主要是通过抑制促凋亡基因Caspase-3和Bax的表达的同时促进抗凋亡基因Bcl-2的表达,从而减少由单侧坐骨神经横断诱导的脊髓和背根神经节细胞的凋亡实现的。