扩展莫尼茨绦虫部分基因表达规律的研究

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扩展莫尼茨绦虫成虫的体节可以划分为幼节、成节和孕节,这种在形态学上的变化,本质上是基因在空间或者时间上差异表达的结果。该绦虫每个节片可以视为一个个体,且每个节片中生殖器官随节片延伸而发生萌发、生长、成熟又凋亡的变化。鉴于该绦虫所具有的独特生长规律,我们利用cDNA文库和cDNA芯片技术筛选出和生殖发育有关的部分差异基因,为以该绦虫作为模式生物研究高等生物甚至人类的生育器官的发育奠定基础;尤其对于揭示同为圆叶目的棘球绦虫--新疆高发高害人畜共患病病原(细粒棘球绦虫和多房棘球绦虫)成虫的生长发育规律,寻找其控制靶点具有重要的实际意义。 本研究采用SMART cDNA文库构建技术构建了扩展莫尼茨绦虫成虫的全长cDNA文库。经测定,该文库的库容量为2.52×105pfu/ml,重组率为94.7%,对文库的克隆进行了5’端随机测序,经过拼接聚类得到1080个unigenes,插入片段的平均长度为495bp,随机抽取32条序列进行全长测序,平均长度为1.39kb。所得到unigenes经BlastN和BlastX分析,可以得知,780个有明显同源性的基因(E-value<10-5),35个是未知功能的基因;GO功能注释,进一步预测基因功能,并通过GO pipe进行了详细的分类。所有的序列登录GenBank EST数据库(登录号:FE905224-FE905315,FE942104-FE942773,FE969189-FE969190,FF677548-FF677734,FF848124-FF848253)。结果表明:扩展莫尼茨绦虫成虫的全长cDNA文库已经成功构建。根据所获得的unigenes制备扩展莫尼茨绦虫cDNA芯片,芯片所用的靶基因点包括cDNA文库所得1080条EST序列,阳性基因(9条),植物(水稻)基因(16条)和空白点(24个)。扩展莫尼茨绦虫的幼节、成节、孕节各节段的总RNA为实验组用Cy5标记,头颈节总RNA为对照组用Cy3标记。结果表明:在幼节、成节和孕节分别有55条、134条、103条上调基因和7条、68条、78条下调基因。大多数的差异基因和代谢、运输、蛋白合成、转录因子、细胞凋亡、细胞分化、细胞通信和核苷酸相关蛋白有关。所有的芯片数据都已经被提交到GEO数据库(登录号:GSE13982)。我们选取反应元件结合蛋白(CREB-binding protein(CBP)),E2型泛素连接酶(ubiquitin-conjugating enzyme E2A-like protein(UBE2A)),β亚型钙离子通道基因(Voltage-gated calcium channel beta subunit(Cavβ)),无精子症缺失基因家族基因(deleted in azoospermia,DAZ)进行实时荧光定量PCR(Real-time PCR)实验验证,结果表明各基因在不同节段的表达情况和芯片的结果一致。
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