热休克同源蛋白70羧基端相互作用蛋白（carboxyl terminus of Hsc70 interacting protein,CHIP）是一种分子量约35kDa的蛋白,在机体内广泛表达,尤其是在骨骼肌、心脏以及脑组织等代谢活跃的组织中表达量更高。CHIP蛋白兼具辅助分子伴侣功能和E3泛素连接酶活性,被认为具有整合、沟通分子伴侣系统与泛素-蛋白酶体系统的特殊作用,在蛋白质质量控制过程中具有重要作用。研究表明,CHIP蛋白参与阿尔茨海默病、帕金森病以及多种polyQ（polyglutamine）疾病如亨廷顿病等的病理生理机制,并能促进对异常蓄积蛋白如p-tau、α-synuclein和polyQ异常扩增蛋白等的降解,从而起到神经保护作用。CHIP蛋白本身突变也可导致神经系统遗传病如脊髓小脑共济失调48型SCA48（Spinocerebellar ataxia type 48）的发生,该病累及小脑等,导致病人出现以共济失调为主的临床表现。值得注意的是,在脑血管病如缺血性脑卒中病人及疾病模型中,也发现CHIP蛋白表达量显著变化,且过表达CHIP蛋白可改善缺血性脑卒中疾病模型的表型。以上研究表明,CHIP蛋白在维持神经系统功能中具有极为重要的作用,过表达CHIP蛋白可能是包括神经退行性疾病和脑血管病在内的多种神经系统疾病的潜在治疗靶点。在本研究中,我们探讨了 CHIP蛋白过表达对脊髓小脑共济失调3型（spinocerebellar ataxia type 3,SCA3）和脑出血（intracerebral hemorrhage,ICH）疾病模型的脑保护作用及作用机制。结果表明CHIP蛋白既可通过调控泛素-蛋白酶体系统（ubiquitin-proteasome system,UPS）或自噬通路活性促进对异常蓄积蛋白的清除,从而参与SCA3的致病机制,也可通过调控坏死性凋亡参与ICH后继发性脑损伤的病理生理过程,且过表达CHIP蛋白对这两种疾病模型均具有脑保护作用。本研究丰富了 CHIP蛋白在神经系统疾病中的作用,为CHIP蛋白作为神经系统疾病的治疗靶点提供了新的依据,具有重要意义。第一部分CHIP蛋白过表达对脊髓小脑共济失调3型的脑保护作用背景:SCA3是世界范围内同时也是我国脊髓小脑共济失调中最为常见的临床类型,在中国大陆占60%以上。目前SCA3尚无有效治疗手段,临床上以对症支持治疗为主要策略,绝大多数患者在10-15年内瘫痪甚至死亡,给患者及家庭带来了沉重的负担。故此,探索SCA3的发病机制及寻找有效的治疗方法一直是该领域亟待解决的关键问题。ATXN3基因10号外显子胞嘧啶-腺嘌呤-鸟嘌呤（cytosine-adenine-guanine,CAG）三核苷酸异常重复扩增所致变异ataxin-3蓄积是该病的典型病理特征,且清除异常蓄积ataxin-3是一种重要的治疗策略,故此积极探索能够有效清除异常蓄积ataxin-3的靶点显得极为迫切和重要。研究表明,CHIP蛋白和ataxin-3存在相互作用,CHIP蛋白可泛素化变异ataxin-3并促进其降解,而变异ataxin-3则导致SCA3疾病模型中CHIP蛋白表达量减低,这些研究提示CHIP蛋白可能参与了 SCA3的致病机制。Williams等报道,CHIP蛋白表达下调可加重SCA3疾病模型的表型,且导致变异ataxin-3的聚集增加。值得注意的是,CHIP蛋白功能缺失可直接导致小脑萎缩及小脑浦肯野细胞的变性甚至死亡,提示CHIP蛋白对维持小脑正常功能具有重要作用。根据此前报道,UPS和自噬参与了 SCA3的致病机制,且增强UPS或自噬通路活性可以促进对变异ataxin-3的降解,而CHIP蛋白则对UPS和自噬等通路活性具有重要调控作用。基于以上研究,我们提出以下科学假说:上调CHIP蛋白表达能够改善SCA3疾病模型的表型,并可能通过增强UPS或自噬等通路的活性促进对变异ataxin-3的降解,从而在SCA3疾病模型中发挥脑保护作用。目的:探讨CHIP蛋白过表达对SCA3小鼠的行为学和组织病理等表型的脑保护作用,同时探讨CHIP蛋白过表达对变异ataxin-3的降解作用及其作用机制。方法:1.应用CRISPR/Cas9技术构建过表达CHIP蛋白的小鼠模型,将其与SCA3小鼠模型杂交,从而获得过表达CHIP蛋白的SCA3小鼠。应用Western blot、免疫荧光等方法检测CHIP蛋白在所构建小鼠脑组织中的表达情况。2.应用转轮、平衡木等行为学分析方法,以及免疫荧光、Western blot、ELISA等分子生物学方法探讨CHIP蛋白过表达对SCA3小鼠的脑保护作用及其作用机制。3.通过构建携带CHIP基因的AAV-PHP.B载体,研究该载体能否有效介导CHIP蛋白过表达,及其对SCA3小鼠模型的脑保护作用。结果:1.成功构建了过表达CHIP蛋白的小鼠模型,该小鼠脑组织尤其是小脑中CHIP蛋白表达量显著增加（P＜0.05）。通过将其与SCA3小鼠模型杂交获得了过表达CHIP蛋白的SCA3小鼠模型。2.CHIP蛋白过表达可显著改善SCA3小鼠的转轮实验掉落潜伏期、步长、平衡木掉落潜伏期等行为学表型（P＜0.05）,且明显延长SCA3小鼠生存期（P＜0.05）,同时改善小脑中浦肯野细胞的丢失（P＜0.05）,并降低血清神经丝轻链蛋白（neurofilament light chain,NfL）的含量（P＜0.05）。3.CHIP蛋白过表达可有效降解SCA3小鼠脑组织中变异ataxin-3及其所形成的聚集体,且能够有效减少小脑和脑干中的包涵体数量（P＜0.05）。其作用机制可能是通过调控HSP70、HSP90等的表达水平增强UPS的活性（P＜0.05）,或通过改善LC3、p62、TFEB、Beclin1等的表达水平增强自噬通路的活性（P＜0.05）。但是需要注意的是在SCA3小鼠小脑、脑干和脊髓等不同受累区域中,HSP70和p62等相关指标的变化并不完全一致,提示在不同的区域中CHIP蛋白调控变异ataxin-3降解的机制可能有所不同。4.携带CHIP基因的AAV-PHP.B载体可介导CHIP蛋白在脑组织中的过表达（P＜0.05）,且其介导的CHIP蛋白过表达可有效改善SCA3疾病模型的表型,并增强对变异ataxin-3的降解（P＜0.05）。结论:过表达CHIP蛋白可显著改善SCA3小鼠的行为学及病理表型;并有效降解变异ataxin-3。CHIP蛋白过表达可能是通过增强UPS和自噬等通路的活性而发挥脑保护作用,但是在SCA3小鼠小脑、脑干、脊髓等不同受累区域其作用机制可能有所不同。AAV-PHP.B载体可有效介导CHIP蛋白在脑组织中的过表达并发挥脑保护作用,表明该载体可作为研究神经系统疾病的有效工具。第二部分CHIP蛋白对脑出血疾病模型的脑保护作用研究背景:ICH是卒中的第二大类型,约占所有卒中的15%。在临床表现上,ICH起病急,病情凶险,具有很高的致残率和致死率。ICH对脑组织的损害主要包括原发性脑损伤和继发性脑损伤,原发性脑损伤是指由于血肿的占位效应所介导的脑组织机械性损伤;继发性脑损伤则主要是指因血肿溶解过程中血液成分的释放等所引起的细胞毒性作用,并最终造成神经元的损伤和死亡。研究表明,继发性脑损伤是影响ICH预后的关键因素,但目前尚无十分有效的治疗方法,因此,旨在减少血肿周围组织中神经元死亡的研究对于ICH的治疗颇为重要。坏死性凋亡是一种受到受体相互作用丝氨酸苏氨酸激3（Receptor interacting serine threonine kinase 3,RIPK3）等蛋白精细调控的细胞死亡方式。新近研究表明,坏死性凋亡是ICH后继发性脑损伤过程中神经元死亡的重要方式,抑制坏死性凋亡可显著减少ICH后神经元死亡,从而改善继发性脑损伤。除参与对异常蓄积蛋白的降解外,CHIP蛋白也参与对多种非异常蓄积蛋白的调控。最新研究显示:坏死性凋亡核心调控蛋白RIPK3也是CHIP蛋白的一种底物,CHIP蛋白能够调控RIPK3的降解,进而调控坏死性凋亡通路的活性。值得注意的是,有研究报道,在缺血性脑卒中病人及疾病模型中CHIP蛋白表达量有显著改变,且过表达CHIP蛋白对缺血性脑卒中疾病模型具有脑保护作用。这表明CHIP蛋白可能参与脑血管病的致病机制,但在ICH中尚无研究报道。基于以上研究,我们提出以下科学问题:CHIP蛋白是否参与ICH后继发性脑损伤的病理生理过程,过表达CHIP蛋白能否通过调控坏死性凋亡而发挥脑保护作用。目的:探讨ICH疾病模型血肿周围组织中是否有CHIP蛋白表达量的改变,探讨CHIP蛋白过表达能否改善ICH大鼠模型的脑损伤及其发挥脑保护作用的机制,从而为ICH治疗提供新的策略。方法:1.构建ICH大鼠模型,利用免疫荧光、Western blot等方法探讨大鼠ICH造模后血肿周围组织中CHIP蛋白表达量的变化。2.构建携带CHIP基因的AAV-PHP.B载体及构建ICH大鼠模型,应用改良大鼠神经功能缺损评分（modified neurological severity score,mNSS）、Western blot、组织病理学等方法探讨CHIP蛋白过表达对野生型（wild type,WT）大鼠ICH造模后继发性脑组织损伤的脑保护作用及其机制。3.应用CHIP突变型大鼠进行ICH造模,探讨CHIP蛋白功能缺失对ICH造模后继发性脑组织损伤的影响,以及CHIP蛋白过表达对CHIP蛋白功能缺失大鼠ICH造模后继发性脑组织损伤的脑保护作用。结果:1.ICH大鼠疾病模型血肿周围的脑组织中CHIP蛋白表达量升高,且在ICH造模后第三天时最为显著（P＜0.05）。2.过表达CHIP蛋白可显著改善WT大鼠ICH疾病模型的mNSS评分、含水量以及血肿体积等脑组织损伤（P＜0.05）,其发挥脑保护作用的机制可能是通过调控RIPK3等蛋白表达量（P＜0.05）,抑制坏死性凋亡的活性从而减少神经元的死亡。3.CHIP突变型大鼠在ICH造模后其脑损伤各项指标如mNSS评分、含水量及血肿体积等较WT大鼠为重（P＜0.05）,给予CHIP蛋白过表达则可以改善因CHIP蛋白功能缺失所引起的大鼠ICH造模后脑损伤加重（P＜0.05）。结论:CHIP蛋白参与了 ICH造模后继发性脑损伤的病理生理过程。CHIP蛋白过表达可以改善ICH大鼠疾病模型的脑损伤,并可能通过调控坏死性凋亡通过的活性减少神经元的死亡,从而在ICH后脑组织损伤过程中发挥脑保护作用。